枸杞多糖对蓝光损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用(无全文)

作者:董卫红;杜秀娟;郭大东;窦冉;解孝锋;毕宏生 刊名:国际眼科杂志 上传者:

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【摘要】目的:研究不同浓度的枸杞多糖对蓝光诱导损伤的体外培养人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞的保护作用。方法:通过蓝光诱导建立hRPE细胞光损伤模型,分别用不同浓度的枸杞多糖(分别为0.01,0.1,1mg/mL)对体外培养的hRPE细胞进行干预,通过流式细胞仪检测各实验组的细胞线粒体活性氧和凋亡率。实验组分为正常对照组、光照损伤组以及不同浓度枸杞多糖(0.01,0.1,1mg/mL)干预组。结果:线粒体活性氧检测:正常对照组荧光强度最小;蓝光损伤组荧光强度最大,不同浓度枸杞多糖处理组荧光度与蓝光损伤组强度相比,荧光强度差异有统计学意义(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI凋亡检测显示不同浓度枸杞多糖干预组凋亡细胞数量与蓝光损伤组凋亡细胞相比差异均有统计学意义(P<0.05);1mg/mL枸杞多糖干预组凋亡细胞数量与对照组凋亡数量相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:枸杞多糖能抑制蓝光诱导损伤的hRPE细胞的凋亡,1mg/mL枸杞多糖抑制蓝光诱导的hRPE细胞凋亡的作用更强,其作用机制可能与抑制细胞线粒体产生活性氧有关。

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0引言年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)是西方国家老年人致盲的首要原因,在我国AMD发病率也在不断上升,是当今老年人不可逆性视力损害的主要原因之一。视网膜光损伤的病理过程与年龄相关性黄斑变性有许多相似之处,对其深入的研究可以为这些疾病的发病机制、治疗提供良好的依据[1]。中药枸杞在临床上被应用于AMD的治疗[2,3],其应用依据是枸杞中的枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)具有增加免疫能力、抗氧化和延缓衰老等功能[4-6]。但对人视网膜色素上皮细胞(humanretinalpigmentepithelium,hRPE)的作用未见报道,本实验通过蓝光诱导建立hRPE细胞光损伤模型,选用不同浓度的枸杞多糖对蓝光损伤的hRPE细胞进行干预,探讨枸杞多糖对光损伤的hRPE细胞的作用和可能的机制,为临床枸杞多糖治疗AMD提供理论基础。1材料和方法1.1材料将冻存的ARPE-19细胞株(上海瑞齐生物有限公司)复苏,复苏好的hRPE细胞置于含10%热灭活胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程有限公司)的DMEM高糖培养液(美国Gibco公司)的培养瓶中,于37,50mL/L二氧化碳的培养箱中培养,约2~3d换一次液,取对数生长期的细胞用于实验;配制含0.01,0.1,1mg/mL枸杞多糖(西安奥泽生物科技有限公司)的DMEM高糖培养液待用;CCK-8试剂盒(贝博公司);胰蛋白酶冻干粉(含EDTA)(美国Sigma公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(晶美生物公司);线粒体膜电位测定试剂盒(碧云天生物公司);线粒体活性氧测定试剂盒(贝博公司),流式细胞仪(美国AccuriC6公司);K5600超微量紫外分光光度计(北京凯奥科技发展有限公司)。1.2方法1.2.1建立hRPE细胞的蓝光损伤模型参照蔡善君等[7,8]建模方法,体外培养hRPE细胞,待细胞铺满或近铺满瓶底时,进行蓝光照射。光照条件:35W白色冷光灯通过蓝色滤光片,波长范围470~520nm,光照强度2000500LUX,光照时间为12h。光照在培养箱内密闭进行,无自然光干扰,光照时温度变化在36.5~37.5之间。光照器放在有自动调温功能的培养箱中,排除温度升高引起细胞光热损伤的可能。1.2.2实验分组A组为正常hRPE细胞6例,无光照损伤;B组6例,蓝光诱导损伤,未加枸杞多糖干预;C~E组各6例,各组在蓝光诱导损伤前30min分别加入0.01,0.1,1mg/mL的枸杞多糖,然后进行蓝光照射,光照持续12h。各组均于光照终止后继续培养24h,然后进行相关 实验。1.2.3倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化各组细胞经不同浓度枸杞多糖处理并蓝光照射12h后,显微镜下观察各组细胞形态。1.2.4检测线粒体活性氧按照11000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10mol/L。光照12h后细胞继续培养24h,然后消化、离心收集细胞(离心800rpm,6min),并用PBS(PH7.4)洗2次,离心收集细胞并调节细胞浓度为1106~2107个/mL,重悬于稀释好的DCFH-DA中,于37二氧化碳培养箱孵育20min,每隔3~5min颠倒混匀,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA,空白组直接用活性氧阳性对照。所有样品用流式细胞仪进行检测。1.2.5AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡率离心收集悬浮细胞,微量离心机转速1000rpm,离

参考文献

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