噬菌体抗体库技术及应用研究进展

资源类型:pdf 资源大小:398.00KB 文档分类:生物科学 上传者:叶世隆

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【作者】 侯佩强 

【关键词】噬菌体 基因 抗体 

【出版日期】2005-04-25

【摘要】噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心,也是其远大前景的基础。噬菌体抗体库的建立对生物学领域许多技术的进展起到很大的促进作用,本文对此项技术的进展情况作一综述

【刊名】疾病控制杂志

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噬菌体抗体库技术 (phagedisplayantibodylibrarytechniques)是指用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增抗体的全套可变区基因 ,通过噬菌体表面展示技术 ,把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面 ,经过“吸附 洗脱 扩增”过程筛选并富集特异性抗体。 2 0世纪 80年代中期 ,Smith在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。由于该技术具有生产人抗体的潜力 ,因此 ,吸引了许多学者投入这一研究中 ,使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展 ,并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线[1] 。1 技术原理噬菌体抗体是在膜表面表达抗体分子Fab或ScFv ,这种膜表达是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成 ,其特点是它既可以识别相应抗原与其相结合 ,又能够感染宿主菌进行再扩增 ,将B细胞全套可变区基因克隆出来 ,组装成噬菌体抗体的群体 ,则成为噬菌体抗体呈现技术[2 ] 。噬菌体抗体库的基本原理是将随机肽段插入到噬菌体衣壳蛋白上形成融合蛋白 ,并利用噬菌体能大量复制的特点 ,得到不同重组噬菌体的多拷贝 ,为不同的研究提供有利的工具。2 噬菌体抗体库的构建噬菌体抗体库按抗体基因的性质分为DNA文库和cDNA文库 ,按抗体基因的来源分天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库等。免疫球蛋白基因可来源于杂交瘤细胞、体外免疫的细胞、致敏及非致敏的B淋巴细胞 (骨髓、外周血、病灶局部引流淋巴结、扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等 ) ,其中以淋巴结的B淋巴细胞较好。建库的大致过程是 :首先提取细胞的总RNA ,经过RT PCR扩增可变区基因 ,运用两种不同的限制性内切酶分别对纯化的轻链PCR产物和表达载体进行酶切 ,再对切割产物进行分离纯化 ,按一定比例将载体和轻链连接 ,转化感受态细胞并扩大培养 ,提取质粒即为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切 ,纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞并扩大培养 ,提取质粒既为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切 ,纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞 ,加入辅助噬菌体培养 ,离心取上清 ,加入聚乙二醇 (PEG)沉淀并收集噬菌体颗粒 ,这样就得到噬菌体总抗体库3 噬菌体抗体库的表达载体和筛选噬菌体抗体库的表达载体可分为λ噬菌体(phageλ)、单链丝状噬菌体 (filamentousphage)及噬菌粒 (phagemid)三种系统 ,这三种系统各有其利弊。λ噬菌体表达系统可通过菌斑印迹 (plaquelift)筛选克隆 ,但外源性片段不能太大 ,其库容量较小 (10 6 )。丝状噬菌体主要为Winter实验室所采用 ,目前已构建了fdCAT1及fdDOGl,并已制备ScFv ;在此载体中又包括单价及多价两个子系统 ,可筛选出高亲和力抗体。噬菌粒是应用最多的表达载体 ,也是简便高效模拟B细胞产生抗体的原核表达系统。建抗体库的目的是筛选出各种特异性的抗体分子 ,噬菌体抗体库在这方面有无可比拟的优势。经典的筛选方法有两种 :一是将纯抗体包被在固相介质上 ,如酶标板、免疫试管或亲和层析柱 ,然后加入待筛选的噬菌体 ,洗去非亲和性的噬菌体 ,回收高亲和性的噬菌体 ;二是将抗体与生物素基团相连 ,再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。在筛选过程中 ,噬菌体种类、固相介质表面的抗原密度或溶液中抗原的浓度和清洗时间三种因素对筛选的效率影响较大。同时 ,每一轮筛选都需要进行检测 ,以证实筛选的有效性。4 噬菌体抗体库技术优势4 .1 能模拟天然抗体库 ,不需要免疫人和动物 在噬菌体抗体库中 ,一方面免疫球蛋白的重链和轻链基因是以人外周血淋巴细胞、骨髓细胞或脾细胞中免疫球蛋白cDNA为模板进行扩增 ,它含有人抗体各种基因信息的全部mRNA ,为全套抗体基因的获得提供了良好材料。另一方面在构建噬菌体抗体库时 ,抗体重链基因和轻链基因在体外的重组 ,造成重、轻链间的配对具有很大的随机性 ,相同的轻链能与不同的重链或相同的重链能与不同的轻链组合在一起 ,这种随机的组合方式进一步丰富了抗体对抗原识别的多样性 ,一般认为 ,10 7个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的 99%。因此 ,构建一个库容量为 10 8的组合噬菌体抗体库 ,理论上认为基本上包括了所有的抗体分子[3] 。4 .2 适应于大规模工业化生产 DNA操作是在细菌中增殖 ,比杂交瘤技术简单快速 ,制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株至少需要数月 ,而噬菌体抗体库技术最短只需几周的时间。噬菌体抗体能够较为容易地对 10 8以上的噬菌体抗体库进行筛选 ,首先通过淘筛的富集作用 ,在一个全套抗体的重、轻链组合噬菌体抗体库中 ,往往能够筛选到多种具有不同抗原结合活性的特异性抗体 ,这些抗体的产生不仅不需要细胞的融合 ,甚至可以不经免疫的个体细胞中提取RNA或DNA ,利用分子克隆技术直接从基因水平制备出所需的抗体。4 .3 可获得不同亲和力的抗体 一般认为 ,机体在初次免疫时 ,产生的抗体多为低亲和力的 ,随着抗原的反复刺激作用 ,便产生多次免疫应答 ,往往造成免疫细胞的抗体基因发生突变 ,产生出高亲和力的抗体。在构建噬菌体抗体库时 ,抗体重链与轻链基因的重组 ,就模拟了机体内抗体亲和力的成熟过程。在噬菌体抗体库中 ,抗体重链与轻链间的配对存在着很大的随意性 ,这往往能改变B细胞中原有的抗体重、轻链间的配对方式 ,产生出不同亲和力的抗体。应用含 gⅢ基因或 gⅧ基因的两套载体 ,就可以对这些不同亲和力抗体加以筛选。5 噬菌体抗体库的应用5 .1 研制疫苗和诊断试剂 噬菌体抗体对于疾病的诊断和疫苗的研究具有巨大的价值。Folgori等[4 ] 人首先提出应用病人的阳性血清中的抗体就可以从噬菌体随机肽库中分离到病原特异性的噬菌体模拟肽 ,并用乙肝病毒感染病人的血清验证了这一方法的可行性 ,他们将得到的能与阳性血清特异结合的噬菌体肽免疫动物所得到的抗体与阳性血清抗体有交叉反应 ,并证实这些噬菌体肽具有疫苗的价值 ,可作为疫苗合成的组分 ;Lundin等[5] 对HIV 1病毒也做了相应的研究 ,从噬菌体抗体库中分离到能够诱发针对HIV 1的免疫反应的噬菌体肽。许多疾病 ,特别是传染性疾病 ,在患者的血清中会留有疾病的印记 ,有些是疾病本身特异性的抗体 ,有些则间接反应了疾病的过程 ,属于非特异性。利用肽库技术 ,采用对照选择 ,即将患者血清和非患者血清暴露于同一肽库进行选择 ,那么 ,疾病的特异性表位就可以筛选出来 ,而不考虑疾病本身是什么 ,特别适用于那些致病机理不清的疾病 ,如自身免疫性疾病。另一方面 ,将重组噬菌体多肽作为抗原模拟肽 ,可用于早期诊断疾病 ,而且制备简单 ,并且 ,可以排除非特异性干扰。例如 ,Davies等[6 ] 就应用肽库技术研究了人类过敏的相关机理。5 .2 表位研究 噬菌体抗体库技术最初在免疫学上是用于抗原决定簇的定位 ,即表位 (Epitope)的研究[7] 。Epitope是配体表面的一段决定位点 ,决定配体的结合特点和折叠状态。Epitope可以是配体一级结构中一段连续的氨基酸残基 ,但多数情况下为不连续的 ,但却包含有结合受体所必需的某些氨基酸 ,通过表位研究可以了解分子与分子之间的作用关系[4 ] 。传统的表位研究大都通过测定经过对抗原进行物理化学的降解所得到的片段或合成一系列来源于抗原的肽段与相关抗体的结合活性分析而得到 ,费时费力。噬菌体抗体库技术的引入就大大简化了这一过程。5 .3 确定核酸结合蛋白 对于一条给定的目标DNA或RNA ,如何决定它的特异性结合蛋白始终是分子生物学家头痛的问题。一个很有前途的方法就是构建DNA或RNA结合域的随机肽库。研究发现 ,DNA或RNA结合蛋白中 ,常存在锌指样的结构 ,有几个特殊氨基酸组成的双螺旋结构 ,表明锌指能为核酸结合蛋白提供一个稳定的框架。通过构建锌指 (一般来源于转录因子A)的随机肽库 ,采用核酸作为靶分子进行筛选 ,可以得到其相应的结合蛋白。也可以利用基因突变技术 ,将螺旋结构中的某个氨基酸转换 ,就可以得到新的DNA结合蛋白。5 .4 基因治疗 人类基因组计划的完成 ,使人类对基因的认识已从结构遗传学研究进入到功能遗传学研究 ,开始用基因方法治疗某些疾病 .多种基因治疗亦取得一定疗效[8] ,但同时也面临许多问题。主要问题之一是如何高效转化特异性外源基因。传统的方法是采用注射 ,直接融合 ,病毒介导等。应用这些方法转化外源基因时 ,外源基因易受到受体体内核酸酶的降解 ,加之受体细胞表面缺乏相应的特异性受体 ,外源基因不能够大量转化进入细胞内 ,使疗效受到影响。噬菌体抗体库技术的发展为基因转化带来很大希望。Romancznk等将呼吸道内皮细胞暴露于随机肽库中 ,筛选出与之相结合的高亲和力的肽分子 ,并用PEG将短肽融合到腺病毒表面 ,以重组腺病毒作为载体将外源基因导入呼吸道内皮细胞内 ,使外源基因得到高效表达 ,治疗效果明显[9] 。5 .5 细胞信号传导与药物开发 随着人类对细胞认识的不断深入 ,人们将更多从分子水平来阐述细胞间的作用机制。信号传导途径已成为细胞学研究的主要内容。传统的方法如酵母双杂交系统只能定性描述信号元件间的相互关系 ,具有局限性。引入噬菌体抗体库技术则使人们能够对其做进一步精细描述 ,更多了解细胞表面的信息 ,其直接的效果是促进了生物药品的开发。受体是细胞同外界联系的通道 ,各种生物因子 (包括一些药物 )都是通过同受体结合而产生相应的生物效应。利用噬菌体抗体库的多样性 ,筛选出能同受体特异结合的重组噬菌体多肽可作为受体的激动剂或拮抗剂 ,分析其结构 ,就可以合成相应的药物。同传统的药物开发相比 ,抗体库具有容量大 ,范围广等优点。6 结论与展望噬菌体抗体库技术诞生以来 ,已经取得了巨大的成果 ,显示它的强大生命力 ,它不仅能够生产具有识别功能的人源性ScFv、Fab双特异性抗体、微型抗体等 ,而且能够筛选和生产具有催化和切割功能的人抗体酶 ,它解决了人源性单抗来源困难、人体杂交瘤系统低效及鼠单抗的动物源性难题 ,对于肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病发病机理的研究、诊断、被动免疫和治疗有极为重要的实验价值 ,成为分子生物学和免疫学领域中一个强有力的研究手段 ,将给新药的开发和疫苗的研制带来极为广阔的诱人前景噬菌体抗体库技术及应用研究进展@侯佩强$泰安市卫生防疫站检验科!山东泰安271000噬菌体;;基因;;抗体噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心,也是其远大前景的基础。噬菌体抗体库的建立对生物学领域许多技术的进展起到很大的促进作用,本文对此项技术的进展情况作一综述[1] GriffithsAD ,DuncanAR .Strategiesforselectionofantibodiesbyphagedisplay[J].CurrOpinBiotechnol,1998,9(1):102106. [2] HoogenboomHR ,DE BeuineAP ,HuftonSE ,etal.Antibodyphagedisplaytechnologyanditsapplications[J ].Immunotechnology,1998,3(4):169176. [3] 王希良,黄云辉,朱锡华.噬菌体呈现技术在人抗体库中的研究策略[J].免疫学杂志,2000,16(1):309312. [4] FoigoriA ,TafiR ,MeolaC ,etal.Ageneralstrategytoidentifymimotopesofpathologicalantigensusingonlyrandom peptidelibrariesandhumansera[J

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