吖啶橙罗丹明6G荧光共振能量转移及其罗丹明6G荧光猝灭法测定蛋白质

资源类型:pdf 资源大小:431.00KB 文档分类:数理科学和化学 上传者:周玲

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【作者】 刘保生  高静  杨更亮 

【关键词】吖啶橙 罗丹明6G 荧光共振能量转移 猝灭法 蛋白质 

【出版日期】2005-04-25

【摘要】研究了吖啶橙(AO)与罗丹明6G(R6G)之间能量转移的最佳条件。在pH=7. 20的Tirs HCl缓冲溶液,十二烷基苯磺酸钠介质中,AO R6G能够发生有效能量转移,使R6G荧光增强。蛋白质的加入使R6G荧光猝灭,以此建立了利用AO R6G荧光共振能量转移间接测定蛋白质的新方法。牛血清白蛋白、人血清白蛋白工作曲线线性范围分别为1. 0~31和1. 0~30mg/L; 检出限分别为0. 32和0. 33mg/L;平行6次测定相对标准偏差为1. 1% ~2. 0%;回收率为96. 7% ~103. 2 %。此方法的稳定性好,选择性高,用于人血清试样中总蛋白含量的测定,与常用的双缩脲法基本一致。

【刊名】分析化学

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1 引  言荧光共振能量转移是指电子激发能,在适当的能量给予体和接受体对之间的传递,传递距离最大可达 7. 0~10. 0nm。该方法已用于无机离子 [1]、有机物 [2]、生物 [3]、分子微区结构的分析以及作为核酸荧光探针的研究 [4]等许多领域。具有比光度法灵敏度高,与常规荧光法和共振光散射相比受瑞利散射光干扰小,重现性好的特点 [5]。本方法作为表征蛋白质的荧光探针的研究尚未见报道。本实验利用吸收光谱和荧光光谱,研究了在十二烷基苯磺酸钠介质中,以吖啶橙 (AO)作为能量给体,罗丹明 6G(R6G)作为能量受体的能量转移体系,发现当AO和R6G摩尔比为 1∶4时,其能量转移最好,蛋白质的加入又使其R6G荧光猝灭。以此建立起AO R6G能量转移荧光猝灭法测定蛋白质的新方法。该体系与蛋白质作用快,方法简便,选择性好,线性范围宽,重现性好。2 实验部分2.1 仪器与试剂RF 540荧光分光光度计(日本岛津公司 );F 4500荧光分光光度计 (日本日立公司 );UV 265紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。牛血清白蛋白(BSA) (北京奥博星生物技术责任有限公司 );人血清白蛋白(HSA) (Sigma公司);卵清白蛋白(OVA) (天津现代高科技研究院);酪蛋白(Casein)。上述蛋白分别配成 0. 1g/L水溶液,于 1~4℃冰箱中 (当日使用 )。吖啶橙 (AO)水溶液: 1. 0×10-6 mol/L;罗丹明 6G(R6G)水溶液: 4. 8×10-6 mol/L;十二烷基苯磺酸钠(DBS)水溶液: 1. 0×10-2 mol/L;三羟甲基氨基甲烷(Tris) HCl缓冲溶液(pH=7. 20): 0. 05mol/L。其余试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。2.2 实验方法于 10mL比色管中,依次加入 1. 8mLpH=7. 20的Tris HCl缓冲溶液, 0. 5mL的DBS溶液, 1. 0mL的R6G溶液, 1. 2mL的AO溶液以及一定量的蛋白质工作溶液,以二次蒸馏水稀释至刻度,摇匀、静置 5min后, 于λex=450nm,λem= 556nm处,测定体系的相对荧光强度ΔI,激发和发射狭缝宽度均为 10nm。3 结果与讨论3.1 吖啶橙与罗丹明 6G分子间的能量转移研究AO的荧光峰波长为 526nm,R6G的吸收峰波长为 532nm,两者差仅为 6nm,AO作为能量给予体, 图 1 荧光光谱Fig. 1 Fluorescencespectra1. acridineorange (AO) + sodiumdodecylbenzenesulfonate (DBS); 2. rhodamire6G(R6G) +DBS;3. AO+R6G+DBS; 4. AO+R6G+DBS + bovineserumalbumin(BSA); cBSA=20mg/L。R6G作为能量受体的能量转移提供了前提条件。为保证能量转移效果,用R6G的吸收强度微弱的端部波长 450nm作为激发波长,对AO、R6G及AO R6G混合体系的荧光光谱进行研究,发现在无表面活性剂时,AO R6G混合体系的荧光光谱只是两种染料的简单叠加,无能量转移发生;当加入十二烷基苯磺酸钠 (DBS)时,混合体系中给体的荧光峰大幅度下降,而受体荧光峰则明显上升(见图 1),两种染料体系间发生了有效的能量转移。实验表明:DBS浓度为5×10-4 mol/L时,能量转移效果最好。3.2 能量给体和受体的浓度对体系能量转移的影响改变AO与R6G摩尔浓度比,绘制荧光光谱。计算表明 [6]:当AO和R6G摩尔比为 1∶4时,AO R6G间的能量转移最好。本实验选择AO和R6G浓度分别为 1. 2×10-7mol/L和 4. 8×10-7 mol/L。 图 2 体系酸度的影响Fig. 2 ThedependenceofAO R6GonpHcBSA=16mg/L。3.3 酸度对蛋白质与AO R6G体系作用的影响当溶液pH在 7. 20时,ΔI达到最大值 (见图 2)。本实验选择pH=7. 20的Tris HCl缓冲溶液控制反应酸度,其最佳用量为 1. 8mL。3.4 共存物质的影响当BSA浓度为 15mg/L时, 40倍L 赖氨酸、L 亮氨酸、L 异亮氨酸、L 精氨酸、L 半胱氨酸, 30倍L 天冬氨酸、L 天冬酰胺、L 脯氨酸、L 苯丙氨酸、L 缬氨酸、L 甘氨酸、KCl,10倍L丙 氨酸、L 丝氨酸、L 甲硫氨酸、L 组氨酸, 5倍BaCl2, 3倍L 酪氨酸、L 苏氨酸、L 谷氨酰胺、L 谷氨酸、CaCO3、ZnSO4、NaCl, 10mg/LL 色氨酸、Al2 (SO4 )3, 20mg/LPb(NO3 )2、MgCl2, 1mg/LFeCl3 不干扰测定,表明本方法具有较好的选择性。由于实际样品测定时需稀释千倍以上,因此,实际样品测定时可忽略这些共存物的干扰。3.5 工作曲线的绘制按照实验方法,绘制牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清白蛋白和酪蛋白的工作曲线(见表 1)。表 1 测定蛋白质的分析参数Table1 Analyticalparametersforproteinsbyfluorescencequenchingmethod蛋白质Protein回归方程Regressionequation线性范围Linearrange(mg/L)相关系数Correlationcoefficientr检出限Detectionlimit(3σ, mg/L)牛血清蛋白BovineserumalbuminΔI= 0.705C+0. 234 0~31. 25 0. 9996 0. 32人血清白蛋白HumansencmalbuminΔI=0.694C+0.043 0~30. 00 0. 9993 0. 33卵清白蛋白OvalbuminΔI=0.802C+0. 015 0~30. 00 0. 9997 0. 28酪蛋白CaseinΔI=0.974C+0. 054 0~20. 00 0. 9989 0. 23 3.6 人血清试样中蛋白质含量的测定利用本方法,对病人血清(样品由保定市第一中心医院提供 )中的蛋白质总量进行测定。测定前,将新鲜血清用水稀释 1000倍,分别取 1. 2mL溶液,按实验方法平行 6次进行测定,结果列于表 2,可知本方法所测结果与医院常用的双缩脲法 [7]基本一致,但灵敏度显著提高。表 2 人血清样品中蛋白的测定结果(n=6)Table2 Determinationresultsfortheproteinsinthehumanserumsamples(n=6)样品Sample本方法 (g/L)Presentmethod双缩脲法 (g/L)Biuretmethod相对标准偏差RSD(% )蛋白质加入量 (g/L)Proteinadded回收率 (% )Recovery1 77. 8 76. 3 1. 48 0. 01 97. 32 72. 9 72. 7 1. 73 0. 01 101. 23 59. 6 57. 9 1. 07 0. 01 103. 24 70. 8 69. 5 1. 57 0. 01 100. 85 78. 3 76. 9 1. 35 0. 01 99. 36 70. 6 68. 3 1. 97 0. 01 96. 7 吖啶橙罗丹明6G荧光共振能量转移及其罗丹明6G荧光猝灭法测定蛋白质@刘保生$河北大学理化分析中心,河北省分析科学技术重点实验室!保定071002 @高静$河北大学理化分析中心,河北省分析科学技术重点实验室!保定071002 @杨更亮$河北大学理化分析中心,河北省分析科学技术重点实验室!保定071002吖啶橙;;罗丹明6G;;荧光共振能量转移;;猝灭法;;蛋白质研究了吖啶橙(AO)与罗丹明6G(R6G)之间能量转移的最佳条件。在pH=7. 20的Tirs HCl缓冲溶液,十二烷基苯磺酸钠介质中,AO R6G能够发生有效能量转移,使R6G荧光增强。蛋白质的加入使R6G荧光猝灭,以此建立了利用AO R6G荧光共振能量转移间接测定蛋白质的新方法。牛血清白蛋白、人血清白蛋白工作曲线线性范围分别为1. 0~31和1. 0~30mg/L; 检出限分别为0. 32和0. 33mg/L;平行6次测定相对标准偏差为1. 1% ~2. 0%;回收率为96. 7% ~103. 2 %。此方法的稳定性好,选择性高,用于人血清试样中总蛋白含量的测定,与常用的双缩脲法基本一致。1 LiuBaosheng(刘保生),WangGuihua(王桂华),SunHanwen(孙汉文),BaoSuoyan(鲍所言),HuangYongzhang(黄永章).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化学),2001,29(1):42~44 2 ZhangZ,RudolfSW.Anal.Chim.Acta,1990,236(2):251~256 3 FengXizeng(冯喜增),BaiChunli(白春礼),LinZhang(林 璋),WangNaixin(王乃新),WangChen(王 琛).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化学),1998,26(2):154~157 4 ZhangZhujun(章竹君).ChineseJournalofAnalysisLaboratory(分析试验室),1993,12(1):25~30 5 LiDonghui(李东辉),YangHuanghao(杨黄浩),ZhengHong(郑 洪),ChenBin(陈 宾),ChenQiuying(陈秋影),XuJin′gou(许金钩).ChineseJ.Anal.

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