转化生长因子β1通过Smad3调控补体应答基因32转录的分子机制

作者:沈云琳;钮小玲;刘华杰;孙蕾;匡新宇;黄文彦 刊名:肾脏病与透析肾移植杂志 上传者:李俊春

【摘要】目的:前期工作发现补体应答基因32(RGC-32)是转化生长因子β(TGF-β)诱导的肾小管上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中Smad信号下游的关键调控分子。本研究拟进一步明确TGF-β诱导肾小管EMT过程中RGC-32的转录调控机制。方法:体外培养NRK-52E细胞,利用荧光素酶报告基因实验检测RGC-32启动子活性以确定Smad结合元件(SBE)是否为TGF-β诱导的RGC-32转录调控位点;通过凝胶迁移率实验(EMSA)明确与之结合的转录调控分子。结果:(1)转染野生型SBE片段的NRK-52E细胞荧光素酶活性明显增高,而转染突变的SBE片段的细胞无此表现,表明SBE是调控TGF-β诱导的RGC-32转录启动的关键位点。(2)合成32P标记的包含SBE的寡核苷酸探针行EMSA可见TGF-β诱导的核蛋白与探针复合物生成,且加入包含SBE序列的竞争片段可以抑制此核蛋白-探针复合物的形成,表明有蛋白与SBE结合并调控RGC-32的转录。(3)当加入不同的Smad抗体行超迁移实验发现Smad2和Smad3抗体可以和复合物相互作用,表明Smad2和Smad3可能是TGF-β诱导的转录复合物的组成部分。(4)将Smad2和Smad3分别与p-1500RGCluc共同转染NRK-52E细胞,Smad3可以显著增加RGC-32启动子活性,表明Smad3是TGF-β诱导的转录复合物的组成部分,而不是Smad2。结论:在TGF-β诱导肾小管EMT过程中,Smad3通过与RGC-32启动子区SBE结合,从而调控肾小管EMT过程。

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慢性肾脏病(CKD)一直是困扰全世界的难题,并严重威胁着人类健康。而肾小管间质纤维化的程度与肾功能下降及CKD的进程密切相关[1-3]。肾小管间质纤维化的一个重要过程是上皮细胞-间充质转化(EMT)[3-5],主要表现为上皮细胞的表型和功能丢失,上皮细胞标志物如E-钙黏蛋白表达降低,而间质细胞标志物如N-钙黏蛋白表达增强,并且获得产生细胞外基质(ECM)的能力,如胶原蛋白,纤维连接蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达增加[6-7]。现已明确转化生长因子β(TGF-β)信号转导通路在肾小管EMT过程中起关键作用,而Smad蛋白是TGF-β信号转导通路中将信号由胞质转导至细胞核的中介分子[8]。然而,TGF-β诱导EMT的详细分子调控机制尚有待进一步阐明。我们先前的研究发现,补体应答基因32(RGC-32)作为TGF-β下游关键调控分子,参与了Smad信号通路介导的肾小管上皮细胞EMT过程[9]。在TGF-β诱导的神经嵴细胞平滑肌细胞分化中,Smad2和PEA3相互作用共同调节RGC-32的转录活性[10]。最近,Guo等[11]发现RGC-32必须与Smad3相互作用诱导人肾小管细胞EMT。但Smad3调控RGC-32的分子机制尚有待明确,为此,本研究通过体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)明确Smad3调控RGC-32转录的分子机制。材料和方法细胞培养和试剂大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)细胞株购自ATCC(American Type CultureCollection)。细胞培养用含5%胎牛血清(GIBCO公司)Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)培养基(GIBCO公司),37℃,95%空气和5%二氧化碳细胞培养箱培养。将NRK-52E细胞按3×105/孔接种至六孔板中培养至80%融合,换无血清DMEM培养基培养6h,然后按实验需要予TGF-β1(5 ng/ml)刺激不同时间后收集细胞用于检测。Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5抗体(兔多抗Ig G)购自Santa Cruz公司。Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5表达质粒[12]及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)均购自于Ori Gene公司。TGF-β1来源于R&D Systems公司。RGC-32启动子质粒构建参照文献10,即利用大鼠基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增RGC-32启动子DNA,并克隆至经Kpn I/Bgl II限制性内切酶消化的含荧光素酶报告载体p GL3-basic(Promega)位点之间。p GL3-RGC-32(-1 500)所包含的调控区域位于RGC-32基因-1 500 bp至22 bp处。引物设计为:正向:5>AAAAGGTACCGCATGCCACATTCTG-ACACC<3;反向:5>AAAAAGATCTCGCTAGCTACT-CGCGTGAG<3。p GL3-RGC-32(-1 500)突变质粒采用Quikchange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit突变试剂盒(Stratagene公司)构建,按试剂盒说明书使用。Smad结合位点(SBE)序列为GTCTGGAC(-1 344 bp至-1 337 bp)突变为GTtat GAC。转染和荧光素酶报告基因实验将NRK-52E细胞以2×105/孔接种于12孔板中培养至细胞80%融合,然后严格按照说明书用Lipofect AMINE

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