热休克处理对视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

作者:徐静;陈尧;牛膺筠 刊名:潍坊医学院学报 上传者:焦玉麒

【摘要】目的研究热休克预处理对热休克蛋白27(HSP27)在视网膜色素上皮细胞(RPE)中表达的影响,探讨热休克预处理对RPE氧化损伤的保护作用及其机制。方法培养的RPE随机分成正常对照组、热休克预处理组、H_2O_2损伤组及热休克预处理加H_2O_2损伤组,将热休克预处理、热休克预处理加H_2O_2损伤组细胞置于42℃水浴中孵育20min进行热休克处理,于37℃体积分数5%CO_2细胞培养箱中继续培养,分别于0h,2h,4h,8h,12h,24h后终止培养,用于实验。H_2O_2损伤组及热休克预处理加H_2O_2损伤组细胞600μmol·L~(-1)H_2O_2处理造成RPE氧化损伤模型;应用免疫细胞化学法检测热休克预处理前后细胞HSP27的表达;流式细胞术检测H_2O_2损伤前后RPE的凋亡情况。结果热休克预处理后RPE HSP27表达出现不同程度增高,与对照组比较,预处理后4h及8h组表达明显增强,Q值分别为9.9133,11.6842,P<0.01;流式细胞仪分析检测结果显示,H_2O_2可以显著降低细胞的活性,与对照组比较,Q值为51.7561,P<0.01。热休克预处理后的RPE表现出时H_2O_2损伤的耐受性,与H_2O_2损伤组比较,预处理后4h加H_2O_2损伤组及8h加H_2O_2损伤组RPE凋亡率明显降低,Q值分别为24.1271,25.5848,P<0.01,且程度与细胞中HSP27表达高低呈一定的相关性(r=-0.9856,P<0.01)。结论热休克预处理可诱导RPE HSP27的高表达并能明显减轻RPE的H_2O_2损伤,其机制可能主要是通过高表达的HSP27保护RPE抑制其凋亡来实现。

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司 ;;; 年龄相关性黄斑变性是我 国主要致盲 眼病 之一 ,严重危 害 患 者 的 视 力 。视 网膜 色 素 上 皮 (,) 的氧化损 伤是 年龄 相关 性 黄斑 变 性病 程 的重 要病 理 机制 。 视野(每个视野面积为 ),应用 图像分析 仪进行 灰度扫描 ,利用分析 软件 ()进行定 量 分析 ,测定 阳性 细胞的平均光密度值 。 位于视 网膜的最 外层 ,具 有多种 功能 ,对 视 网膜 内层 起保 流 式 细胞 荧 光 标 记 双 染 法 检 测 凋 护作用 ,但在发挥 生理功 能 的同时容 易受 氧化 等应 激损 伤 ,是 亡 以每孔 个孔 ,密度接种 于 孔板 中,培养 视 网膜光 损伤及年龄相关 的黄斑 变性 ()等一些 视 网膜疾 后 ,分为正常对照组 、热休 克预处 理组 、损 伤组 、热休 克预 病 中最初 损伤的靶组织 。本 实验 通过建 立体外 培养 的 氧 处理后 损伤组 组 (每组 孔细胞)。按照上述模 型处理 化损 伤模 型 ,检测热休 克预处理前后 活力 以及热 休克蛋 白 后 ,用 胰蛋 白酶 , 消 化细胞 ,在 (,)表达 的变化 ,进 一步探 讨其 细 室 温 下 离 心 ,用 不 含 和 “ 的 液 清 洗 遍 。根 胞保护机制 ,为临床应用提供实验依据 。 材 料 和 方 法 仪 器 与 试 剂 光 学 显 微 镜 (日本 ),电 热 恒 温 培养箱 (上海 ),恒 温水 浴 箱 (上 海 医 疗 器 械 厂 ), 型 流 式 细 胞 仪 (美 国 公 司 ), 显 微 摄 影 器 材 (日本 )。人 (美 国 细 胞 培 养 收 集公 司 ,一细胞 ),免疫组化试剂 盒(天津灏 洋生物 制品科技公司 ),兔抗人 单克隆抗体 (北京莱博生 物实 验 材料研究所 ),双染法流式细胞试剂盒 (北 京 宝赛生物试剂公司 ),显色试剂 盒(博士德生物工程有 限公 司 )。 细胞 复苏 从 一超 低温冰箱 中取 出装有需 复苏 细胞 的冻存管 ,置于 水 中迅 速解冻 ,取 出细胞悬 液 , 培养液洗 涤 ,离心 ,弃上 清 ,加入含有 胎牛血清的 培 养液 制 成 细 胞 悬 液 ,调 整 细 胞 浓 度 为 个接 种 入 培养瓶 中 , :培养 箱 中培 养。次 日更 换培 养 液继 续培养 ,然后每 更 换 次培养 液 ,细胞 近铺满 时 ,以 据北京宝赛 生物技术 有限公 司提供 的 双染 法 流 式 细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒 说 明 对 组 样 本 进 行 凋 亡 细 胞 观 察 。结合 进行双 染色可 以用于 检测活 细胞 、凋 亡 细胞和坏死细胞 。正常活细胞不会被染 色 ,即 一一,凋亡 细胞可被标记上 ,但对 是拒染 与 细胞 凋亡相关性 的为 一,坏死 和凋 亡晚期 细胞可被 和 同时 染 色 。 统计学处理 所有数据以 表示 ,采用 统计 软件 ,采用单 因素方差分析 ,以 为差 异有 显著性。 结 果 热 休 克 预 处理 对 人 表 达 的 影 响 免 疫 细胞 化 学结果显示 ,正常对照组 细胞 中仅有 微量 表 达 ,热休 克 预 处 理 组 表 达 较 正 常 对 照 组 升 高 ,不 同时 间 表 达 强 度 不 同,在预处理 后 时表达开始 升高 ,达 到高 峰 ,时染 色强度呈下 降趋 势 ,随预处 理 时间 延长 ,以后逐 渐减 弱 。热 休 克预处理组各 时间段 细胞 表达水平 与正常对 照组 比较 , 结果见 表 。 的胰 蛋 白酶消化传代用于试验 。

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