大鼠PAX6基因真核表达载体构建及鉴定

作者:严会文;苏敏;高杰;廖文萍;闫丽丽;黄悦 刊名:贵阳医学院学报 上传者:沈理

【摘要】目的:构建携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因及PAX6基因的重组真核表达载体,观察其在人胚肾细胞(293FT)细胞中的表达。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)从大鼠脑组织中获取PAX6基因,经连接T载体测序验证正确后,与真核表达载体p EF1α-IRES-Ac GFP经Sal I/Bam HI双酶切后;经T4 DNA连接酶连接,获得重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP,用菌液PCR、Sal I/Bam HI双酶切及测序鉴定正确后,用脂质体法转染293FT细胞,采用倒置荧光显微镜观察GFP的表达、蛋白印迹(Western blot)法检测PAX6蛋白表达。结果:重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP经RT-PCR和双酶切均得到大小为1 269 bp的目的条带,测序鉴定该序列与Gen Bank中大鼠PAX6基因序列的同源性达100%,插入基因的大小和方向正确;重组质粒转染293FT细胞后可见GFP绿色荧光,Western blot显示PAX6蛋白表达。结论:成功构建了PAX6真核表达重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP,能在293FT细胞中表达PAX6蛋白。

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第 41卷 第 3期 2016年 3月 贵 阳 医 学 院 学 报 JOURNAL OF GUIYANG M EDICAL COLLEGE Vo1.41 No.3 2016.3 大 鼠 PAX6基 因真核表达载体构 建及 鉴定 严会文一 ,苏 敏 ,高 (贵州医科 大学 组织学与胚胎学教研室 杰,廖文萍,闫丽丽,黄 贵州 贵 阳 550004) 悦一 米 [摘 要 ]目的:构建携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因及PAX6基因的重组真核表达载体,观察其在人胚肾 细胞(293FT)细胞中的表达。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)从大鼠脑组织中获取 PAX6基因,经连接 T载 体测序验证正确后 ,与真核表达载体 pEF1Ot—IRES—AcGFP经 SalI/BamHI双酶切后;经 T4 DNA连接酶连接,获得 重组质粒 pEFla—PAX6一IRES—AcGFP,用菌液 PCR、SalUBamHI双酶切及测序鉴定正确后 ,用脂质体法转染 293FT 细胞,采用倒置荧光显微镜观察 GFP的表达 、蛋白印迹(Western blot)法检测 PAX6蛋白表达。结果:重组质粒 pEF1 —PAX6一IRES—AcGFP经 RT—PCR和双酶切均得到大小为 1 269 bp的目的条带,测序鉴定该序列与 GenBank 中大鼠PAX6基因序列的同源性达 100%,插入基因的大小和方向正确;重组质粒转染293FT细胞后可见 GFP绿 色荧光,Western blot显示 PAX6蛋白表达。结论:成功构建了PAX6真核表达重组质粒pEF1 —PAX6.IRES—AcG— FP,能在 293FT细胞 中表达 PAX6蛋 白。 [关键词 ]绿色荧光蛋白;PAX6基因;表达载体,真核;脂质体;转染 [中图分类号]R329.2 [文献标识码]A [文章编号 ]1000—2707(2016)03-0288-06 Construction and Authenticate of Eukaryotic Expression Vector with Rat PAX6 YAN Huiwen,SU Min,GAO Jie,LIAO Wenping,YAN Lili,HUANG Yue (Department of Histology and Emb~ology,Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou,550004) [Abstract]Objective:To construct a green fluorescence protein report gene(GFP)and an eukaryot— ic expression vector of rat PAX6 gene and,observe its expression in 293 FT cells. M ethods:The rat PAX6 gene was amplified by Polymerase Chain Reaction(PCR).After verified correctness of sequen. cing by connection with T vector.the recombinant products of the pEF1 Or. 一 PAX6.IRES.AcGFP were gained by T4 ligase connecting pUCm—T—PAX6 and eukaryotic expression vector pEF1 -I

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