远志皂苷元对氧化应激损伤的视网膜神经节细胞的保护作用

作者:别曼;徐颖;胡慧玲;逯丹;朱丽红;戚仁斌;王华东;陆大祥 刊名:中国病理生理杂志 上传者:袁利

【摘要】目的:观察远志皂苷元(senegenin,Sen)对氧化应激损伤的视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)的影响并初步探讨其作用机制。方法:采用上丘荧光金逆行标记RGCs后,体外原代RGCs混合细胞培养,随机分为control组、H2O2组、Sen+H2O2和Sen组。检测带荧光金荧光细胞的活力。同上述分组处理视网膜,用Hoechst 33258染色后观察视网膜细胞核形态的变化,Western blotting检测视网膜细胞cleaved caspase-3、细胞色素C及Bcl-2蛋白的表达。结果:与control组比较,Sen浓度在10、20和40μmol/L时,RGCs活力无明显变化(P>0.05),但Sen浓度达到80和160μmol/L时,RGCs活力明显下降,差异显著(P<0.01)。25、50、100和200μmol/L H2O2明显降低RGCs活力(P<0.05)。Sen浓度在10、20和40μmol/L时,对50μmol/L H2O2损伤的RGCs有较好的保护作用(P<0.05),其中40μmol/L Sen保护作用最为明显。Hoechst 33258染色表明Sen可以减少H2O2引起的视网膜细胞凋亡。Western blotting结果表明Sen促进Bcl-2蛋白的表达,降低线粒体细胞色素C的释放,下调cleaved caspase-3的表达。结论:Sen保护RGCs对抗氧化应激引起的损伤,其机制可能与其增强Bcl-2蛋白表达和减少氧化应激引起的细胞凋亡有关。

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视神经损伤是眼科和神经科的常见疾病,也是致盲的主要原因之一,病因涉及诸多因素。研究表明,外伤、青光眼[1]、缺血[2]及神经轴突损伤等[3-4]因素造成的视神经损伤,能够引发视神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)内氧化应激的发生,从而导致RGCs原发或(和)继发性死亡,且死亡形式主要为细胞凋亡。抗氧化的药物目前有多种,如中药类、维生素类及多糖类等。在中药类药物中,单体远志皂苷元(se-negenin,Sen)在改善学习与记忆能力[5]、抗衰老[6]及抗氧化等[7]方面有显著作用。本教研室的前期研究发现,远志皂苷元具有抑制A25-35诱导的PC12细胞凋亡,并且对缺氧/复氧损伤的PC12细胞,远志皂苷元也表现出一定的保护作用。然而远志皂苷元对氧化应激损伤的RGCs有何影响尚不清楚。本研究选取远志皂苷元作用于发生氧化应激损伤的RGCs,观察其是否对损伤的RGCs有保护作用,并初步探讨其作用机制。材料和方法1材料1.1动物出生35d的SPF级Sprague-Dawley(SD)乳鼠,由南方医科大学动物实验中心提供。动物合格证编号为SCXK(粤)2006-0015。1.2主要试剂荧光金(fluorogold,FG;Invitrogen),neurobasal培养基(含L-glutamine,Gibco),甲基纤维素(methycellulose,StemcellTechnologies),硫酸庆大霉素(Amresco),B27(Gibco),L-谷氨酸盐(Sig-ma),木瓜蛋白酶(Worthington),L-半胱氨酸(Sig-ma),多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL,Sigma)[8-9],H2O2(广州化学试剂厂),Sen(中国药品生物制品检定所,纯度>98%),3-tubulin抗体(CST),荧光抗AlexaFluor594(Invitrogen),Hoechst33258凋亡试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所),3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)抗体(CST),Bcl-2抗体(Abcam),细胞色素C抗体(CST),cleavedcaspase-3抗体(CST)。1.3仪器超净台,CO2恒温培养箱,荧光显微镜(Leica-DFC310FX),微量进样器(Hamilton,10L),Westernblotting蛋白印迹电泳仪和蛋白印迹电转仪(Bio-Rad)。2方法2.1上丘FG逆行标记视神经节细胞取出生35dSD大鼠,以囟点Bregma为起始点,水平旁开1mm处左右各取1点。每个点注射深度分别为2.0mm和1.5mm,0.6%FG溶液在每个深度注射量为1.25L。注射后微量进样器针头留置2min,每侧注射总量为2.5L[8-9]。2.2视神经节细胞的体外培养与鉴定2.2.1提前24h在24孔板的孔内铺直径1.3cm的无菌圆玻片,0.1%PLL包被玻片。取提前34d上丘FG标记的SD乳鼠,无菌条件下取双侧视网膜,以5105U/L木瓜蛋白酶37消化后,制备成混合细胞悬液[5-6]。测细胞密度为(48)109/L。混合均匀后分到各孔中,每孔含细胞液体量达300L。待3h细胞基本贴壁,再培养细胞15h。之后用4%多聚甲醛固定细胞20min,PBS液洗3遍,每次5min。RGCs鉴定采用免疫细胞化学法,以3-tubu-lin(11000)特异性标记视网膜神经细胞。能被FG和3-tubulin标记的视网膜神经细胞即为视神经节细胞。2.

参考文献

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