化瘀克塞汤预处理对局灶性脑缺血大鼠HSP70表达的影响

作者:王运满;李长生;杨晓妮 刊名:山东大学学报(医学版) 上传者:袁利

【摘要】目的探讨不同剂量化瘀克塞汤对大鼠局灶性脑缺血的保护作用及对热休克蛋白(heat shock protein,HSP)70表达的影响。方法采用线栓法制备大脑中动脉缺血模型。Wistar大鼠60只随机分为假手术组、缺血组、化瘀克塞汤预处理高剂量组(含生药2.34 g/mL,1 mL/100 g)、化瘀克塞汤预处理低剂量组(含生药1.17 g/mL,1 mL/100 g),造模前7 d灌胃给药,1次/d,假手术组与缺血组则相应给予生理盐水。持续性缺血6 h后处死动物,观测各组大鼠脑梗死体积,神经元受损程度,采用RT-PCR法和免疫组化方法分别检测缺血脑组织HSP70 mRNA和蛋白的含量。结果局灶性脑缺血6 h后,化瘀克塞汤预处理高、低剂量组可明显减轻神经元受损程度,降低脑梗死体积(P<0.01,P<0.05)。缺血组HSP70 mRNA及蛋白表达明显增强,化瘀克塞汤高剂量组与缺血组相比,HSP70 mRNA及蛋白表达水平明显较低(P<0.01,P<0.05),在低剂量组也较低(P<0.01,P<0.05)。结论化瘀克塞汤预处理可使局灶性脑缺血大鼠HSP70表达下降,可能与化瘀克塞汤对脑缺血的保护作用减轻了应激反应有关。

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热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70是机体在应激状态下出现的一种特殊蛋白,正常情况下,HSP70在脑内无表达或呈低水平表达,脑缺血后受损细胞的变性蛋白可诱导其合成,其表达的强度可在一定程度上反映神经细胞损伤程度及对缺血损伤的耐受性,是脑缺血损伤耐受现象的标志[1]。化瘀克塞汤主要由生黄芪、川芎、三七等组成,具有益气活血功效,临床治疗缺血性脑血管病疗效显著。本实验选用永久性局灶性脑缺血模型鼠,观察化瘀克塞汤预处理对脑缺血早期脑损伤的影响,研究化瘀克塞汤对局灶性脑缺血大鼠是否具有脑保护作用,并探讨其对HSP70表达的影响。1材料与方法1.1主要试剂Trizol为Invitrogen公司产品,TaqDNA聚合酶、AMV逆转录酶、Rnasin、dNTPs均购自Promega公司;HSP70引物、-actin引物由上海生工生物技术工程服务公司合成;小鼠抗大鼠HSP70单克隆抗体购自美国CST公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG,SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂合购自武汉博士德公司。1.2实验动物及分组Wistar大鼠60只,SPF级8~10周龄,280~320g,雌雄各半,山东大学实验动物中心提供,合格证号:SCO0K鲁221030004。大鼠随机分为4组,每组15只:假手术组、缺血组、化瘀克塞汤(HYKSD)高剂量组、化瘀克塞汤(HYKSD)低剂量组,(每组各取5只用作脑梗死体积测定、5只用于检测mRNA、5只用于组织形态学检查及HSP70蛋白的检测)。1.3药物及给药方法化瘀克塞汤主要由生黄芪、三七、川芎、地龙等组成,单剂为江阴天江药业有限公司生产的中药配方颗粒,加水煮沸溶解,药液置4冰箱保存备用,实验时恢复至室温。依据《中药药理研究方法学》[2]推荐的实验动物与人用药量换算方法,对大鼠用药剂量进行推算,化瘀克塞汤高低剂量组分别配制为含生药2.34g/mL,1.17g/mL的水溶液,按1mL/100g体重供每天灌胃使用。造模前7d灌胃给药,1次/d,假手术组、缺血组给予等量生理盐水。1.4动物模型建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型参照Longa等[3]线栓法建立,持续性缺血6h后处死动物。模型成功标志为出现同侧Honer征及对侧肢体瘫痪,无上述神经功能缺失症状及意识障碍的大鼠不入组。1.5脑梗死体积的测定大鼠局灶性脑缺血6h后断头取脑,沿视交叉水平取2mm厚的冠状切片,立即置于2%氯化-2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染液中闭光、37孵育30min,正常脑组织被染为红色,梗塞灶为白色。数码相机拍照后置于10%甲醛中固定。采用MPIAS2500图像分析软件进行处理,计算梗死体积及其占全脑体积的百分比。1.6组织形态学检查大鼠达到缺血时限后,10%水合氯醛过量麻醉,由左心室灌注37生理盐水150mL,再灌入4%多聚甲醛(pH7.4,4)150mL后断头取脑,于视交叉前缘行冠状切块,常规石蜡包埋、连续冠状切片,片厚5m,分别进行苏木精-伊红(HE)染色与HSP70免疫组化分析。行HE染色后,光镜下观察缺血侧大脑皮层的组织形态学变化。1.7RT-PCR法检测大鼠脑组织中HSP70mRNA的表达1.7.1引物合成引物设计参照Nakahara等[4]提供的序列,由上海生工生物工程技术公司合成。引物序列为:HSP70上游引物:5GAGTCCTACGCCT-TCAATATGAAG3,下游引物:5CATCAAGAGTCT-GTCTCTAGCCAA3;扩增片断长度为347bp;-actin上游引物:5TCATGCCATC

参考文献

引证文献

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