靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

作者:陈岐辉;卢绩;王小庆;王春喜;姚子明 刊名:中国实验诊断学 上传者:游国宾

【摘要】目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。

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Piwi基因是一种在干细胞分裂中具有重要调控作用的基因,于1997年由LinH和SpradingAC首先在果蝇的生殖干细胞内发现[1]。piwi基因家族在进化中具有高度的保守性,在线虫、鼠、拟南芥等其他动物和植物中都发现有其同源物,在干细胞的自我更新、配子形成、RNA干扰以及翻译调节中具有重要作用。Hiwi为其在人类组织中的同源物之一,近来的研究表明,HIWI基因可能参与了干细胞增殖,并且其过表达可能引起干细胞的恶性进展[2]。RNA干扰现象(RNAinterference,RNAi)是通过导入双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)分子,可以高效、特异阻断体内某些基因,致使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺乏的表型,达到转录后水平的基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)的过程。这一自然科学界的重要发现,目前已广泛用于基因功能及基因治疗的研究[3]。因此,本研究通过构建靶向HIWI基因的短发夹RNA(shout-hairpinshRNA)真核表达载体,为今后通过RNAi技术抑制HIWI表达,从基因与蛋白质水平探索HIWI基因在干细胞及肿瘤中的作用打下基础。1材料与方法1.1材料大肠杆菌DH5a由吉林大学公共卫生学院放射生物教研室保存并提供。真核表达载体pGenesil-2质粒购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司。限制性内切酶BamHI、HindIII、SalI及T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公司。小量质粒提取试剂盒购自中鼎公司。1.2方法1.2.1靶向HIWI基因的shRNA序列的设计根据Genebank中HIWI基因mRNA序列(AF104260),采用Ambion公司的网上设计软件(http://www.ambion.com),参考shRNA的设计原则[4],设计两段shRNA靶序及一段不针对任何基因的阴性对照shRNA序列,并通过BLAST对所选择的靶序列进行同源分析,排除shRNA非特异性抑制其它基因片段的可能。shRNA序列茎环结构为9个与HIWI基因不互补的非同源碱基(TTCAAGACG),末端终止了为T,在合成的DNA片段末端设计SalI酶切位点。设计的具有发夹结构的shRNA干扰片段序列如下:结构模式为:BamHI+Sense+Loop+Antisense+终止信号+Sall+HindIIIHIWIlAATTATTTGGCCGTGGACGGCHIWIl-A5-GATCCGTTATTTGGCCGGTGGACGGCTTCAAGACGGCCGTCCACGGCCAAATAATGTCGACA-3’HIWIl-B3-’GCAATAAACCCGGCACCTGCCGAAGTTCTGCCGGCAGGTGCCGGTTTATTACAGCTGTTCGA-5’HIWI2263CGGTAATTGTGGTGAAGAAHIWI2263-A5-GATCCGCGGTAATTGTGGTGAAGAATTCAAGACGTTCTTCACCACAATTACCGTGTCGACA-3’HIWI2263-B3-’GCGCCATTAACACCACTTCTTAAGTTCTGCAAGAAGTGGTGTTAATGGCACAGCTGTTCGA-5’阴性对照GACTTCATAAGGCGCATGC阴性对照-A5-GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTGTCGACA-3’阴性对照-B3-’GCTGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTC

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