蒺藜皂苷对体外培养视网膜神经节细胞的保护作用

作者:黄丽娜;王丽纯;应方微;曾平 刊名:中国中医眼科杂志 上传者:闵锋

【摘要】目的观察不同浓度蒺藜皂苷(GSTT)对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)存活率的影响。方法将出生后1~3天的SD乳鼠视网膜细胞,应用不同浓度的蒺藜皂苷分别与细胞共培养24h后,用MTT法检测492nm吸光度A值,并计算相应的存活率。结果10-7g/L浓度的GSTT组RGCs的存活率为112.86%,(设对照组存活率为100%),10-7g/L浓度的GSTT组RGCs的存活率高于对照组(P<0.05)。结论GSTT能增加体外培养的大鼠视网膜神经节细胞的存活率,具有促进混合培养RGCs生长的作用。

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青光眼导致视功能损害的病理基础是视网膜神经节细胞进行性死亡和视神经纤维丧失。青光眼的治疗目的在于保护视神经功能,但目前视神经保护治疗还无有效的方法。近年来中医药对视神经节细胞及视神经损害的治疗取得了一定的成绩1,2,3。研究发现蒺藜皂苷(GSTT)对大鼠视网膜神经节细胞的存活和生长有保护作用,现将结果报告如下:1材料和方法1.1材料出生1~3天SD大鼠(广东省医学实验动物中心),GSTT粉剂(吉林敖东洮南药业股份有限公司),DMEM培养基(MBchem公司),新生牛血清(杭州四季青公司),胎牛血清(杭州四季青公司),多聚赖氨酸(福州迈新公司),胰蛋白酶(Gibco公司),四唑盐剂(MTT)(福州迈新公司),二甲基亚砜(DMSO)(福州迈新公司),二氨基联苯胺(DAB)(福州迈新公司),Thy-1单克隆抗体(Santacruz公司),神经原特异性烯醇酶(NSE)单克隆抗体(武汉博士德公司),S-P试剂盒(福州迈新公司)。1.2实验方法:1.2.1RGCs体外培养培养板处理:配制0.1mg/mL多聚赖氨酸溶液,加入培养皿(预先置入4块22cm22cm盖玻片)和96孔培养板内,每孔1mL,室温放置,过夜,弃去多聚赖氨酸液,紫外线消毒30分钟,待用。RGCs原代培养:新生1~3dSD大鼠断头处死,解剖显微镜钝性分离视网膜神经上皮层。0.25%胰蛋白酶37消化20分钟,终止消化后,1000r/min离心5分钟,D-Hanks液清洗2次,加入DMEM完全培养基(含10%新生牛血清,10%胎牛血清),调整细胞密度为106个/毫升。接种于多聚赖氨酸包被的96孔培养板中,每孔90L细胞悬液,置于5%CO2培养箱37培养。图1接种24hRGC细胞,成圆形,串珠状,部分已贴壁(400)。图2视网膜神经节细胞特异性标记抗体Thy-1抗体染色,棕黄色为阳性细胞(400)。图3视网膜神经节细胞特异性标记抗体NSE抗体染色,棕黄色为阳性细胞(400)。1.2.2MTT检测参照司徒镇强方法4将96孔培养板分为4组,每组9孔:A组(对照组)、B组(10-7g/LGSTT)、C组(10-6g/LGSTT)、D组(10-5g/LGSTT),实验组分别加入不同浓度GSTT10L,对照组加入培养液10L,培养24小时后,每孔加入MTT(5g/L)20L,继续培养4小时后,去上清液,每孔加入DMSO150L,充分混匀后,用酶标仪在492nm波长测定吸光度A值,并计算细胞存活率。细胞存活率=实验组不同浓度平均吸光度值/对照组平均吸光度值。1.2.3RGCs的鉴定:用Olympus相差倒置显微镜下观察活细胞的形态及生长规律的方法进行形态学观察。而细胞免疫化学染色则是:从培养皿中取出培养24小时覆有培养视网膜细胞的盖玻片,待干燥后,按S-P试剂盒说明方法进行细胞免疫化学染色,使用的第一抗体为抗大鼠Thy-1单克隆抗体(1:100)及NSE抗体(1100),DAB显色,苏木素复染,中性树脂封片。1.3统计学方法使用SPSS13.0统计软件,采用t检验进行统计分析。2结果2.1形态学观察Olympus相差倒置显微镜下观察,细胞于培养4~6小时开始贴壁,24小时细胞成圆形,串珠状,部分已贴壁(图1)。加入GSTT各浓度实验组与对照组细胞在形态学上无明显差异。2.2细胞免疫化学检查DAB染色显示大部分取材的细胞经Thy一1抗体和NSE抗体染色呈棕黄色,Thy一1抗体和NSE抗体染色阳性,符合视网膜神经节细胞的特性(图2,3)。2.3MTT检测2.3.1未加干涉的对照组(A组)吸光度值为0.38630.3

参考文献

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