大鼠CD40基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定

作者:王楠;马庆久;鲁建国;何显力;邹爱民;李坤 刊名:医学研究生学报 上传者:王元

【摘要】目的:构建靶向大鼠CD40基因小分子干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体。方法:利用Ambion公司的网上设计工具,设计2个靶向CD40基因的发夹状siRNA,通过化学合成的方法合成2对分别互补的寡核苷酸链,退火后将双链DNA片段连接至pSilencer4.1-CMV neo vector的多克隆位点,转化扩增提取质粒,对重组质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定。结果:经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与pSilencer4.1-CMV neo vector连接正确,靶向大鼠CD40基因的siRNA重组表达质粒构建成功。结论:成功构建了大鼠CD40基因的RNA干扰真核表达载体pSilencer4.1-CMV-CD40.1和pSilencer4.1-CMV-CD40.2,为进一步研究CD40基因在同种器官移植排斥反应中的作用奠定基础。

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0引言CD40为CD40配体(CD40ligand,CD40L)的受体,其基因定位于20q11,是型跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。CD40的分布尚未完全清楚,但它主要表达于B细胞、巨噬细胞、树突细胞(dendriticcell,DC)、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞及一些T细胞表面。CD40可能作为一种调节因子,调节DC免疫刺激功能、T细胞克隆增殖、B细胞产生抗体、巨噬细胞效应功能以及内皮细胞黏附分子的表达。CD40和CD40L的相互作用在T淋巴细胞的活化及免疫应答过程中发挥着重要的调节作用[1]。最近的研究表明[2],一些短片段的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。RNAi技术不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制,而且还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,可广泛应用于包括功能基因组学、药物靶点筛选、细胞信号转导通路分析和疾病治疗等领域[3,4]。本实验利用高效的pSilencer4.1-CMVneoVector构建针对CD40的小干扰RNA(smallinterfer-ingRNA,siRNA)真核表达载体,为下一步转染入目的细胞,并探讨抑制同种异体器官移植排斥反应的新方法奠定基础。1材料和方法1.1材料和试剂设计的siRNADNA编码序列由北京奥科公司合成,BamH和Hind限制性核酸内切酶等购于Takara公司,pSilencer4.1-CMVneo载体及阴性对照pSilencer4.1-CMVneonegativecon-trol为Ambion公司产品。大肠杆菌感受态DH5为本实验室的保存株,质粒抽提试剂盒为U-geneBiotechnology公司的H.Q.&.QPlasmidMinikit(ZL-1-1-2),TaqDNA聚合酶、DL2000DNAMarker及琼脂糖凝胶均购自鼎国生物技术有限公司。1.2引物的设计和合成根据GenBank提供的大鼠CD40基因序列(NM_134360),按照siRNA的设计原则[5],利用Ambion公司提供的网上在线设计工具(www.ambion.com/techlib/misc/psilencer_con-verter.html),扫描CD40基因ORF序列中的AA序列,记录每个AA的3端19个氨基酸作为潜在的siRNA靶位点。通过BLAST分析,去除那些含有超过16~17连续碱基对同源性的靶序列。计算靶位点的GC含量,选择GC含量在40%~55%的序列作为候选位点。按在ORF平均分布的原则,最终选择495-515、704-724作为干涉区域。根据RNA干涉载体pSilencer4.1-CMVneo的要求分别于上、下游引入BamH和Hind酶切位点。每段各设计一对55个碱基的序列,由奥科生物技术有限公司合成。两对CD40基因的siRNAcDNA序列如下:pSilencer4.1-CD40.1(sense):5-GATCCGCTGTGAAGATCAGAAGCTTTCAAGAGAAGCTTCTGATCTTCACAGCTTA-3,(antisense):5-AGCTTAAGCTGTGAAGATCAGAAGCTTCTCTTGAAAGCTTCTGATCTTCACAGCG-3;pSilencer4.1-CD40.2(sense):5-GATCCGATCCTGTGGAGATAGAAGTTCAAGAGACTTCTATCTCCACAGGATCTTA-3,(antisens

参考文献

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