雌激素对人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

作者:许广昌;周占宇;公慧敏;王荣荣;钱诚 刊名:眼科研究 上传者:周莲

【摘要】目的探讨雌激素对过氧化氢(H2O2)氧化损伤人视网膜色素上皮(RPE)细胞的保护作用及其机制。方法制作人RPE细胞氧化损伤模型,分为对照组、H2O2损伤组和预处理组,后者于损伤前24h加入17β-E2,根据17β-E2的浓度分为10-6、10-5、10-4μmol/L亚组。采用分光光度计测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率及细胞脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的浓度,细胞免疫组织化学法检测bcl-2的表达情况。结果H2O2损伤组与对照组相比,LDH释放率、MDA浓度明显升高,而bcl-2的表达减少,差异有统计学意义(P<0·05);各预处理组与H2O2损伤组比较,LDH释放率、MDA浓度均有降低,而bcl-2的表达增加,差异有统计学意义(P<0·05)。随17β-E2浓度的增加LDH释放率、MDA浓度减少,bcl-2的表达增加。结论雌激素对H2O2诱导的人RPE细胞的氧化损伤有保护作用。

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视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞在维护视网膜正常生理功能方面具有极其重要的作用。大量的动物实验及临床研究[1-3]显示雌激素通过清除自由基、抗氧化、抗神经凋亡及减少缺血再灌注损伤等达到对脑组织的保护作用。而RPE细胞作为脑神经组织的延续,雌激素是否具有保护作用,国内外尚未见报道,鉴于此我们采用600mol/L过氧化氢(H2O2)制作氧化损伤模型,观察雌激素对人RPE细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。1材料与方法1.1材料DMEM,新生牛血清,胰蛋白酶,青霉素和链霉素(Gibco公司);人RPE细胞(美国细胞培养收集公司);17-雌二醇(美国Sigma公司);H2O2(北京中山试剂公司);乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物研究所);兔抗人bcl-2单克隆抗体(天津灏阳生物公司);SABC免疫组织化学试剂盒,DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。1.2方法1.2.1人RPE细胞的复苏和培养RPE细胞的复苏:将存放有RPE细胞的冻存管从-70超低温冰箱中取出,立即置于5565水浴中,不断摇动,使其尽快融化(12min),此时管内温度约为37。迅速加入10倍含有10%新生牛血清的DMEM培养液,混匀离心,弃去上清液。细胞计数,0.4%台盼蓝染色测定细胞存活率,以2104个/mL细胞密度接种于培养瓶中,次日换液去除未贴壁的细胞。RPE的培养:将复苏的人RPE-19细胞置于5%CO2孵箱内培养,每3d换液1次,细胞长至近融合状态时,用0.25%胰蛋白酶消化、传代。将0.8cm0.8cm大小的盖玻片置于24孔板中,每孔以2104个/mL细胞密度接种,以制作细胞爬片。1.2.2模型制作及分组待培养人RPE细胞生长近铺满玻片时,无血清的DMEM液洗3遍,将其分为3组,每组包括5个培养孔细胞:(1)预处理组,加入17-E2作用24h之后,加入600mol/LH2O2作用6h,依17-E2浓度不同分为3个亚组(10-6、10-5、10-4mol/L)。(2)H2O2损伤组,损伤处理及培养条件同前组,但是不加17-E2。(3)对照组,不加17-E2及H2O2损伤,相同条件培养。1.2.3LDH释放率和MDA浓度检测样本收集:H2O2损伤后,立即收集培养上清液及细胞裂解液(通过将细胞先后置于-70超低温冰箱及37水浴箱内反复冻融,使其胞膜破裂,释放细胞内的LDH)进行测量。利用南京建成生物工程研究所生产的LDH和MDA检测试剂盒,按其说明用722型分光光度计测定培养液及细胞裂解液中LDH的吸光光度值和MDA浓度。1.2.4bcl-2的细胞免疫组织化学染色的检测用4%多聚甲醛固定RPE细胞爬片30min;室温下1%的H2O2处理10min,PBS(pH=7.4)洗涤3min3次;正常山羊血清封闭液室温孵育20min,倾去山羊血清封闭液;滴加150稀释的兔抗人bcl-2单克隆抗体,4过夜;滴加生物素标记的山羊抗兔抗体,37孵育1h;滴加辣根过氧化物酶工作液37孵育1h(以上各步间均用PBS冲洗3次,每次3min)。DAB显色,充分水洗后,复染,乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。其中一组用苏木素复染供拍照用;用PBS代替一抗作为阴性对照。每张细胞爬片随机取5个视野,应用图像分析仪进行灰度扫描,利用分析软件(MetaMorphImagingSystem)进行半定量分析,所得平均灰度值作为该标本bcl-2蛋白的表达水平。1.3统计学分析实验数据以xs表示,采用SPSS11.5统计学软件,各组内多个样本均数的

参考文献

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