副粘病毒Tianjin株F基因真核表达载体的构建及初步鉴定

作者:张国际;李晓眠;钟启平;李梅 刊名:天津师范大学学报(自然科学版) 上传者:刘清毅

【摘要】为研究仙台病毒主要表面抗原f蛋白对小鼠的免疫效果,应用RT-PCR从副粘病毒Tianjin株基因组中扩增出F基因,将其插入pcDNA3的Pcmv下游,构建了F基因真核表达载体,同时使用PCR、限制性酶切和测序等方法对其进行了鉴定,鉴定结果证实构建成功.构建好的F基因真核表达载体可为下一步的体外表达和动物免疫实验奠定基础.

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近年来,在某高校实验动物中心普通棉耳狨猴群体暴发的急性呼吸道感染中分离出一株高血凝效价的病毒株,经初步确认为仙台病毒[1],并命名为仙台病毒天津株,后更名为副粘病毒Tianjin株.在前后两次的上呼吸道感染人群的血清学调查中,发现20%~50%患病人群具有该病毒的抗体[2].本研究构建了该株病毒F基因真核表达载体,尝试以核酸疫苗的形式来预防普通棉耳狨猴群体再次发病,此疫苗可能成为预防人类副流感病毒感染的备选疫苗.1材料和方法1.1材料副粘病毒Tianjin株、pcDNA3质粒(均为本室保存),病毒RNA提取试剂盒(购自QIAGEN公司),逆转录酶(购自Invitrogen公司),限制性内切酶(EcoRI和NotI)、T4DNA连接酶和DNA凝胶回收试剂盒(为大连宝生物公司产品),T载体(购自天根生化科技有限公司),大肠杆菌Top10(购自天津润泰公司),寡核苷酸引物(由上海生工公司合成),其他试剂均为国产分析纯.1.2主要仪器PCR扩增仪(eppendorf公司),空气浴振荡器(ZHWY-100A,上海智城分析仪器制造有限公司),DYY-III10型电泳仪,-20低温冰箱等.1.3方法1.3.1病毒RNA的提取按试剂盒提供的说明书进行.工作原理是利用制备膜技术有选择性地结合核酸,从而获得高纯度的病毒RNA.取血凝效价为12560的副粘病毒鸡胚尿囊培养液140L,经裂解、结合、润洗与离心、洗脱与离心等操作,最终获得60L的病毒RNA洗脱液,将其分装10L于0.5mL的微量离心管中,储存于-20备用.1.3.2RT-PCR合成、扩增F基因1)引物设计.根据前期工作结果,使用GeneRunner3.04设计一对引物,即F上游引物5-’GAATTCATGGCGACCTATACTTTAAGA-3’,F下游引物5-’GCGGCCGCTCATCTTTTCTCAGTCAT3’.其中,F基因上下游引物的5’端分别含有EcoRI和NotI的酶切位点,以FcDNA为模板可以扩增出1.7bp的含有F基因的DNA片段.2)RT-PCR反应.将仙台病毒RNA,上、下游引物(10mol/L)和dNTP(10mmol/L)依次加入到容量为0.5mL的Eppendorf管中,进行逆转录反应.反应完成后,将反应液分装4L/管,备用.将上述反应液,上、下游引物(10M),dNTP(10mM),PCRBuffer和ExTaq(5U/L)加入于50L的反应体系中,进行PCR扩增.其反应条件为94,7min预变性;94,30s,55,30s,72,1min进行30个循环;72延伸7min.然后将PCR产物置于4保存备用.取10LPCR产物在1%琼脂糖凝胶(含0.5g/mLEB)上电泳以鉴定PCR结果.1.3.3PCR产物的回收PCR产物的回收按试剂盒提供的说明书进行.1.3.4PCR产物与T载体的连接连接产物转化感受态细胞Top10,PCR初步鉴定为阳性克隆,反应条件同上.挑取3个阳性克隆,在LB培养基中37振摇培养,小量制备质粒,按试剂盒提供的说明书进行.1.3.5EcoRI和NotI双酶切F基因及酶切片段的回收将含有F基因的T载体使用两种内切酶进行消化,然后回收.按照文献[3]和试剂盒提供的说明书进行.1.3.6真核表达载体pcDNA3.F的构建质粒pcDNA3的小量提取、EcoRI和NotI双酶切pcDNA3及其大片段的回收、pcDNA3大片段和F基因酶切片段的连接反应及连接产物转化感受态细胞Top10等操作,按照文献[3]进行.1.3.7真核表达载体pcDNA3.F构建的初步鉴定采

参考文献

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