靶向大鼠TGF-β1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

作者:都泓莲;张千;邓存良 刊名:生物医学工程研究 上传者:宋亚亭

【摘要】构建并鉴定靶向大鼠TGF-β1基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,为探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。根据大鼠TGF-β1基因的mRNA序列设计并合成2条编码shRNA的特异性寡核苷酸片段,另选通用阴性对照序列HK,将上述片段退火后分别克隆入线性化质粒载体PGenesil-1.1中,构建出含靶基因片段的shRNA真核表达载体PGenesil-TGF-β1-A、PGenesil-TGF-β1-B及PGenesil-HK,行酶切鉴定及测序分析,并采用脂质体介导法体外转染Hela细胞,荧光显微镜观察转染结果。经酶切和测序鉴定证实,构建的shRNA成功插入到载体,重组质粒的插入序列与设计的靶基因片段完全一致,3种重组质粒均能转染入Hela细胞表达绿色荧光。成功构建出靶向大鼠TGF-β1基因的shRNA真核表达载体,为后续研究抗肝纤维化的基因药物奠定了实验基础。

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生 oam 物 al 医。 学 工 程 研 究 2014 .33(2}:93Jouma of Biomedical Engineering Research 一97 u L ● 。 J, 靶 向大 鼠 TGF—l3 1基 因 shRNA真核 表达 载体 的构 建及鉴定 都泓莲,张千,邓存良△ (泸州 医学院 附属 医院感染病科 ,泸州 646000) 米 摘要 :构建并鉴定靶 向大鼠 TGF一131基 因的短发 夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体 ,为 探 索肝 纤维化的基 因治疗提供有力工具。根据大鼠 TGF一131基 因的 mRNA序 列设计并合成 2条编码 shR. NA的特异性寡核苷酸片段 ,另选通 用阴性对照序列 HK,将上述 片段 退火后分别克 隆入 线性化 质粒载体 PGenesil一1.1中,构建 出含靶基 因片段 的 shRNA真核表达载体 PGenesil—TGF一131一A、PGenesil—TGF— B1一B及 PGenesil—HK,行酶切鉴定及测序分析 ,并采用脂质体介导法体外转染 Hela细胞 ,荧光显微镜观察 转染结果。经酶切和测序鉴定证实,构建的 shRNA成功插入到载体,重组质粒的插入序 列与设计的靶基 因 片段完全一致,3种重组质粒均能转染入 Hela细胞表达绿色荧光。成功构建出靶向大鼠TGF—Bl基因的 shRNA真核表达载体 ,为后续研究抗肝纤维化的基 因药物奠定 了实验基础 。 关键词 :肝纤维化 ;TGF一131;RNA干扰 ;质粒 ;基 因重组 中图分类号 :R318 文献标识码 :A 文章编号 :1672-6278(2014)02-0093-05 Construction and Identification of Eukaryotic Expression Plasmids Containing Short Hairpin RNA Targeting at Rat TGF—I3}1 gene DU Honglian,ZHANG qian,DENG Cunliang (Infection Department of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,China) Abstract:To construct and identify eukaryotic expression plasmids containing short hairpin RNA(shRNA)that target at rat TGF一 131 gene and to provide a powerful tool for exploring a promising gene therapy way of hepatic fibrosis.Two pairs of shRNAs that target at rat TGF—B1 gene were designed,and no—isogeny gene segment HK was selected as a negative contro1.Atfer annealed,the inserts were separately ligated into the lineafized pGenesil一1.1 plasmids.The eukaryotic expression plasmids pGenesil—TGF一81一A,pGenesil— TGF—B1一B and pGenesil—HK

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