茶树八氢番茄红素脱氢酶cDNA全长克隆与表达分析

作者:李娜娜;邵文韵;刘畅;陆建良;梁月荣 刊名:茶叶 上传者:黄燕萍

【摘要】八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素生物合成途径的关键酶之一。本实验采用3'/5'RACE和RTPCR技术成功扩增出茶树八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的3'端和5'端序列,序列拼接获得全长cDNA序列,命名为CsPDS,并将其登录至GenBank,登录号KF646537。经生物信息学分析,所得基因cDNA序列全长为2295 bp,开放阅读框(ORF)1749 bp,编码582个氨基酸,预测分子量约为64.86 kDa,理论等电点(PI)为6.77,属于亲水性蛋白。该基因编码的氨基酸序列与柿树PDS序列的同源性达到87%,多序列比对表明茶树PDS具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树、葡萄的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,CsPDS在‘黄金芽’体内表达没有受抑制,表明‘黄金芽’黄色白化可能不是在CsPDS基因转录水平异常而引起。

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类胡萝卜素是广泛存在于植物体内的一类色素,是含有多个共轭双键的萜烯类化合物,在植物生命中发挥重要作用,具有捕获光能,消除氧自由基的光保护功能,同时为植物生长调节剂脱落酸及其他激素类物质合成提供底物[1-2]。类胡萝卜素各组分的颜色具有差异性,在非绿色组织内,积累某些独特的成分,植株器官所呈现出来的颜色也不相同,如无色的八氢番茄红素和六氢番茄红素,浅黄色的-胡萝卜素,橙黄色的链孢红素,红色的番茄红素,黄色的叶黄素,橘黄色的-胡萝卜素[1]。八氢番茄红素脱氢酶(EC:1.3.5.5,phytoenedesaturase,PDS)是类胡萝卜素生物合成途径(pathway:map00906)中的关键限速酶之一,催化八氢番茄红素(phytoene)两步脱氢转化为-胡萝卜素。PDS基因的突变和抑制性表达,会大量积累八氢番茄红素,减弱叶绿素、类胡萝卜素和赤霉素的生物合成,植株呈现白化和矮化的外在表型[3];当含有PDS基因片段的重组质粒病毒侵染植物后诱导靶基因沉默,由于PDS的mRNA表达受到抑制,侵染发病的植物叶片出现白化现象[4-7]。‘黄金芽’由白化突变新梢培育而成,全年白化,叶片黄色,是新型光照敏感型茶树品种,成品茶具有氨基酸含量高、滋味鲜爽、香气悠长等优良品质特征[8-10]。为探究PDS基因是否是‘黄金芽’产生白化现象的关键调控因子,本实验利用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)和RT-PCR技术,克隆获得茶树八氢番茄红素脱氢酶的全长基因,结合实时荧光定量PCR技术[11-12],分析比较PDS基因在正常绿色茶树品种‘福鼎大白茶’、黄色白化突变品种‘黄金芽’及遮荫处理‘黄金芽’中的表达变化,同时该基因的获得也为利用基因工程手段调控茶树类胡萝卜素物质的生物合成打下基础。1材料与方法1.1材料供试材料为茶树品种‘福鼎大白茶’、‘黄金芽’、30%遮荫度‘黄金芽’及60%遮荫度‘黄金芽’的新梢一芽二叶,采自浙江省杭州市富阳茶园,取样后迅速用液氮冷冻处理,然后置于-80冰箱保存备用。1.2方法1.2.1总RNA提取和cDNA第一链合成采用Trizol法(裂解液购自TaKaRa公司,CodeNo.9109)提取总RNA,方法步骤参照文献[13]。以提取所得茶树总RNA为模板,OligodT为引物,按照PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesis试剂盒(TaKaRa公司,CodeNo.6110A)操作说明书合成cDNAD第一链。1.2.2PDS基因3'端序列(3'RACE)和5'端序列(5'RACE)的获得根据已发表八氢番茄红素脱氢酶中间序列(GenBank:EU275984.1),利用PrimerPremier5.0软件设计引物。3'RACE特异性引物:5'-TGCTATTGAAGGAGATGCCTATG-3',预测产物大小900bp;5'RACE特异性引物:5'-ACCTAGAATTGCTGGAATGAGTCC-3',预测产物大小950bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。3'端序列的操作步骤依次按照3'-FullRACECoreSetVer2.0试剂盒(TaKaRaCode:D314)说明书进行。反转录反应。套式PCR反应,包括OuterPCR和InnerPCR反应。取20lInnerPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测,并切胶回收目的片段,保存于-20。5'端序列的获得采用5'-FullRACEKit试剂盒(TaKaRaCode:D315)进行套式PCR反应。去磷酸化处理。使用alka

参考文献

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