芦丁对神经细胞氧化损伤的保护作用

作者:张浪;赖永长;汪海涛;王日康;孟茜;郑文华 刊名:中药材 上传者:刘行海

【摘要】目的:考察芦丁(RUT)对硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)致神经细胞损伤的保护作用,并探讨其作用的信号通路。方法:通过不同剂量SNP处理PC12细胞,建立细胞损伤模型;采用噻唑蓝(MTT)法考察RUT对细胞存活的影响;以Hoechst Stain、PI Stain观察细胞形态;以蛋白印迹(Western blot)检测细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平;在原代皮质神经元上验证RUT的神经保护作用。结果:MTT结果显示SNP能剂量依赖性地降低PC12细胞的存活,25μg/mL的RUT能显著增加SNP(800μmol/L)处理后PC12细胞的存活率(P<0.05)。Hoechst Stain、PI Stain证实RUT能显著减少PC12细胞的死亡。Western blot结果显示RUT能显著促进ERK1/2的磷酸化,在皮质神经元上也证实了RUT的保护作用。结论:RUT对SNP诱导神经细胞损伤具有显著的保护作用,其神经保护作用可能是通过ERK1/2信号通路介导的。

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神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病等是一类严重影响人类健康的常见病,对其发病机制的研究表明,氧自由基增多、脂质过氧化和钙稳态失调、细胞色素C的释放,是氧化应激增强的主要原因,最终将导致神经元凋亡或坏死的发生1。芦丁(rutin,RUT)在临床上常用于防治高血压脑溢血、糖尿病视网膜出血和出血性紫癜等,其是否具有对抗NO损伤从而保护神经细胞的作用则未见有报道。本实验通过培养PC12细胞及原代皮层神经元,并用硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)造成神经一氧化氮(NO)损伤模型,在此基础上考察RUT对神经细胞存活率及对神经细胞形态学的影响,为将RUT开发为具有神经保护作用的中药单体提供理论依据。1材料与试剂1.1细胞株高分化的PC12细胞株由加拿大Mcgilluniversity道格拉斯研究中心RemiQuirion教授馈赠。1.2药物与试剂RUT购自中国食品药品检定研究院(批号:0080-2005);硝普钠(SNP)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶为Sigma公司产品;hoechst33342(编号:C1022)及PI(Propidi-umIodide)染液(编号:ST511)购自碧云天生物科技公司,Anti-phospho-AKT(Ser473)抗体、Anti-phospho-ERK1/2抗体为CellSignalingTechnology公司产品;MAP-2抗体为SignalwayAntibody公司(美国)产品;DMEM、Neurobasal、B27、HBSS、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;三联抗生素(PSA)购买自碧云天公司。1.3主要仪器1X-71型荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯公司);细胞培养箱(ThermoElectronCorpora-tion);酶标仪(CliBiol28,美国)。2方法2.1PC12细胞的培养依据郑文华等2建立的方法进行培养:使用含体积分数分别为5%的胎牛血清和5%的马血清、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL的DMEM培养基,置于37,体积分数5%的CO2培养箱中培养。用0.25%胰酶-0.02%ED-TA每隔2~3d消化传代备用。2.2原代皮质神经元培养3取新生乳鼠(SPF级新生昆明乳鼠,出生1d,购自中山大学实验动物中心,合格证号:00331575),75%冷乙醇浸泡3~5min,无菌条件下断头,取出大脑,放入预冷的HBSS平衡盐液中。仔细分离去除脑膜及血管,分离出大脑皮质并剪碎成约1mm1mm1mm大小。组织块以0.25%胰蛋白酶消化,用含5%FBS+2PSA的DMEM培养基制成单细胞悬液,以1106/mL接种在经poly-Dlysine处理过的培养板中,第2天换液,用2%B27的Neurobasal于37、体积分数5%的CO2培养箱中进行培养,以后每隔3d以Neurobasal/B27半量换液。2.3细胞存活率(MTT法)4细胞接种于96孔无菌培养板中,设空白对照组、模型组及给药组,每组每浓度设置5个复孔,于37条件下培养24h后,加10LMTT(10mg/mL),继续培养4h,抽去上清液,每孔中加入100LDMSO,微振荡后,用全自动酶标仪在570nm波长处测量光密度D()值。2.4Hoechst33342染色、PI染色5PC12细胞中预先加入RUT预适应2h后,使用SNP培养24h后进行实验。加入稀释的Hoechst33342染液及PI染液,10min后荧光倒置显微镜下拍照计数。2.5免疫细胞化学取培养7d的神经元,进行

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