猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析

资源类型:pdf 资源大小:779.00KB 文档分类:生物科学 上传者:殷隽

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【作者】 孙世惠  周艳荣  卢建申  邓继先 

【关键词】 血清白蛋白 基因文库 噬菌斑原位杂交 聚合酶链反应 绿色荧光蛋白 

【出版日期】2005-04-30

【摘要】目的:克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法:以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究。结果:共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号:AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%。荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达。结论:获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。

【刊名】军事医学科学院院刊

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人血清白蛋白在体内具有非常重要的生理功能[1],能与激素、药物等结合,起着运输的作用;并能维持体内的胶体渗透压。因此,人血清白蛋白在临床上发挥着非常重要的作用,如用于手术输血和危重患者的液体补给,治疗创伤休克、发热、水肿、低白蛋白血症和红细胞过多等症。但由于人血清白蛋白来源有限且易受到病原微生物的污染,因此,利用基因工程技术生产重组人血清白蛋白替代人血源白蛋白是目前最有发展前景的途径之一[2]。在家畜中,家猪生长迅速、易于管理,加之遗传背景、器官大小、形态和功能与人有高度的相似性,因此,猪在生物医学领域中越来越受到人们的关注。为了研究在猪白蛋白的基因座定位敲入人白蛋白基因的转基因猪,首先需要构建基因打靶载体,而前提之一是获得猪白蛋白基因作为基因打靶的同源臂,鉴于GenBank中并未公布猪血清白蛋白基因序列,因此本研究从猪噬菌体文库中克隆了猪血清白蛋白基因组全序列并进行序列的测定及分析,为进一步利用猪进行基因打靶生产人血清白蛋白奠定了良好基础[3]。血清白蛋白基因启动子具有组织表达的特异性,仅在肝脏来源的组织中特异性表达[4]。目前对猪的白蛋白基因功能分析还没有相关报道,因此本实验对猪白蛋白启动子的转录功能进行了初步探讨,为将来利用此启动子进行肝组织的特异性表达研究和进行基因治疗提供了宝贵资料。1材料和方法1.1材料随机引物标记试剂盒、pGEM TVectorkit、DNA提取试剂盒购自Promega公司;Piggenomeλgt11phagelibrary购自Clontech公司;[a32p]dCTP购自亚辉公司;E.coliDH10β、pGEM7Zf质粒、Ploxp质粒、pT BGHPolyA质粒由本室保存;E.coliDH5αcompetentcells和DNAstandardMarker购自天为时代公司;引物均由国家生物医学分析中心合成。QIA prepspinminiprepkit(50)购自Qiagen公司;Gelextraction minikit(50)购自上海华舜生物工程公司;T4DNApolymer ase购自华美公司;PyrobestDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Promega公司;内切酶分别购自Biolab公司和TaKaRa公司。1.2方法1.2.1猪基因组DNA的提取取冷冻的猪肝组织进行猪基因组DNA的提取。提取方法参照分子克隆实验指南。1.2.2探针的制备及引物的合成由于猪血清白蛋白基因较大,根据人白蛋白基因推测猪白蛋白基因约有16kb,而λ基因组文库中插入片段的平均长度为16kb,一次杂交很难筛到基因全长,因此分别从基因的5′端和3′端设计并制备探针进行杂交,以期获得包括猪血清白蛋白基因5′端调控序列和3′端未翻译序列区在内的白蛋白基因全长。本实验根据Gen Bank公布的猪血清白蛋白基因启动子(promoter)序列及已经发表的cDNA序列设计并合成引物,以猪肝中提取的基因组DNA为模板,扩增猪白蛋白基因片段,作为杂交探针;引物均由国家生物医学分析中心合成。D123:5′CAGATCCAG ACGGCAAACACACGC3′;D61:5′CTCGACGAAACA CACCCCTGG3′;D81:5′CGTTACACCAAGAAAGTACC3′;D82:5′CTCCACAGCAAAGCAGGCCTC3′。正向引物D123,反向引物D61分别位于猪血清白蛋白基因启动子区和第1外显子上,合成的基因片段作为5′端杂交探针。正向引物D81和反向引物D82位于猪血清白蛋白第13外显子上,合成的基因片段作为3′端杂交探针。5′端PCR扩增条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸20s,扩增30个循环;72℃延伸10min。3′端PCR扩增条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸18s,扩增30个循环;72℃延伸10min。随机引物法标记DNA放射性探针(按照randomprimed DNAlabelingkit,Promaga试剂盒进行)。1.2.3猪λ噬菌体基因组文库的筛选及白蛋白序列的测序1.2.3.1噬菌斑原位杂交参照分子克隆实验指南进行。1.2.3.2PCR方法以噬菌斑中重组λ噬菌体DNA为模板,以引物D123和D61进行5′端克隆PCR筛选。D81和D82进行3′端克隆PCR筛选,PCR反应条件同上述5′端及3′端基因片段扩增条件。选择经第1轮噬菌斑杂交和PCR交替筛选鉴定的阳性噬斑重新铺制大板,按上述方法分别用3′,5′端探针进行第2轮杂交。筛选出的阳性噬斑分别用引物D123、D61和D81、D82进行PCR鉴定。经2轮杂交和PCR筛选,获得阳性克隆并铺板保存。1.2.3.3噬菌体DNA的大量提取及快速分析将通过杂交和PCR交替筛选获得的阳性噬菌体单斑进行扩增,并进行噬菌体DNA的大量提取,提取方法见分子克隆实验指南。1.2.3.4目的基因片段的克隆选择XhoⅠ酶切噬菌体DNA,并将酶切后的目的片段克隆至pGEM7Zf载体上,分别命名为p7Zf N51,p7Zf N52,p7Zf N31,pp7Zf N32。对重组子进行PCR和酶切鉴定,并进行基因序列的测定及分析。1.2.4猪血清白蛋白5′端调控序列的克隆及功能鉴定1.2.4.1猪血清白蛋白基因5′端调控序列的克隆以5′端第1次杂交筛选得到的克隆p7Zf N51为模板PCR扩增5′端调控区ATG上游1382bp的片段,亚克隆至pEGFP1载体上,得到重组载体pEGFP15′S。由于5′端第1次杂交筛选得到的基因片段其5′端序列与第2次得到的猪白蛋白调控序列在PacⅠ位点处交叠,因此通过PacⅠ位点将5′调控区ATG上游1382bp的片段连接到第2次克隆载体(p7Zf N52)上,然后酶切下7.2kb的5′端调控序列,并亚克隆至pEGFP1载体上,得到重组载体pEGFP15′L。1.2.4.2EGFP表达载体在HepG2中的表达采用脂质体介导的方法用pEGFP15′S,pEGFP15′L分别转染HepG2细胞,转染后48h内对细胞分别进行瞬时转染的检测,EGFP的定性检测采用荧光显微镜。对镜下发荧光的细胞进行照相。2结果2.1猪血清白蛋白基因部分片段的获得以猪肝组织DNA为模板,分别以D123、D61及D81、D82为引物,PCR扩增分别获得白蛋白基因5′调控区和第13外显子部分DNA片段,长度分别为285bp(图1A)和197bp(图1B),琼脂糖凝胶电泳及测序仪自动测序,证实可作为筛选猪基因组文库的杂交探针使用。杂交前按照同位素标记试剂盒操作说明书进行32P标记。图15′端和3′端部分片段PCR扩增A:1.M1DNA标志物;2.PCR结果B:1.M2DNA标志物;2.PCR结果;3.阳性对照;4.阴性对照2.2猪血清白蛋白基因克隆及重组子的鉴定经噬菌斑原位杂交及PCR交替筛选,获得阳性噬菌体单斑,按分子克隆实验方法大量提取λDNA,XhoⅠ酶切,亚克隆至pGEM7Zf的XhoⅠ位点,并对重组子进行PCR筛选及XhoⅠ酶切鉴定(图2,图3)。2.3猪血清白蛋白全基因序列的测定及分析通过4轮噬菌斑杂交及PCR的交替筛选,共获得猪血清白蛋白全基因约35kb,其中包括15个外显子及14个内含子约19592bp,5′端调控序列约14275bp,3′端调控序列约3690bp。此结果已在GenBank登录,登录号为AY663543。图2噬菌斑原位杂交结果图3重组质粒酶切鉴定1.M6DNA标志物;2.XhoⅠ消化重组质粒图4为筛选出的启动子区以及基因第4外显子、第9外显子中与网上公布的启动子区序列和部分第4外显子、第9外显子的比对结果,发现启动子区有2个碱基与公布的不一致;第4外显子的最后一个碱基由A变为G,第9外显子中第2个碱基由C变为G。图4克隆的猪血清白蛋白基因与网上公布序列的比对结果2.4猪白蛋白启动子的转录功能鉴定以EGFP为报告基因,人肝癌细胞系HepG2为靶细胞进行白蛋白启动子转录功能分析。用构建的2种EGFP表达载体转染HepG2,24h后荧光显微镜观察,2种载体转染的HepG2细胞均有EGFP的表达(图5,图6)。图5pEGFP15′S转染HepG2(×400)图6pEGFP15′L转染HepG2(×400)3讨论近2年利用基因打靶和核移植相结合的方法相继生产出敲除了α1,3半乳糖苷转移酶基因的转基因猪[5]。这一研究结果说明采用类似方法制备生产人血清白蛋白的转基因猪是完全可行的。用基因打靶的方式将人血清白蛋白基因定位敲入到猪的胎儿成纤维细胞,经体细胞核移植,从而生产出含人血清白蛋白的转基因猪。由于猪血清白蛋白基因序列还没有人分析和报道,而构建打靶载体需要猪血清白蛋白的5′端调控序列、基因组序列和3′端未翻译序列,因此需要从猪基因组文库中克隆这些序列,用于打靶载体的构建,但目前我们仅知道猪血清白蛋白基因cDNA序列及猪白蛋白启动子区序列,因此只能以此为基础,制备探针,从猪基因组文库中克隆出猪血清白蛋白基因组全序列。本研究采用噬菌斑和原位杂交交替筛选的方法,即在2次原位杂交之间直接以噬菌体悬液中释放的噬菌体DNA为模板应用PCR方法对初步获得的克隆进行筛选,快速排除由于噬菌斑密度过大、定位偏差、杂交噪声等因素而造成的假阳性克隆,避免了多次提取DNA的烦琐程序,从而提高了文库筛选的效率。此外,在筛选基因组文库时参考本实验室以前的工作经验[6],将λ噬菌体DNA酶切后直接沉淀回收,用于质粒的亚克隆,避免了酶切后λ噬菌体载体臂与插入片段大小相近而造成的回收困难等问题。本研究将获得猪血清白蛋白全基因启动子序列与网上公布的启动子区序列相比对,发现其中的224个碱基中有2个碱基与网上公布的序列不一致,这可能是由于猪的品种不同而导致的,但启动子区的主要调控元件如TATA盒、CAAT盒均与网上公布的相一致;同时将克隆的猪白蛋白基因与GenBank中的猪白蛋白编码区序列相比对,发现有2处的碱基发生了改变,但第4外显子中碱基的改变并不影响所编码的氨基酸,均编码赖氨酸;而第9外显子中碱基的改变使得编码的氨基酸由苏氨酸变为精氨酸,分析原因可能是由于种属之间的差异引起的。此外,本研究将猪的白蛋白全基因与人的白蛋白基因进行了比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区的同源性为82.3%,内含子区同源性较低,但是第1内含子和第12,13内含子同源性较高,达到70%以上,而第11内含子与人的同源性最低,仅为21.7%,因此可以推测第1内含子和第12,13内含子可能与基因的转录功能密切相关,而第11内含子区域可能与其种属特异性关系更为密切,但仍需通过实验进一步证实。总之,以上实验结果为利用猪血液制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础。本实验对猪的血清白蛋白启动子转录功能活性进行分析。将白蛋白启动子连接于报告基因EGFP翻译起始密码子的上游,然后瞬时转染HepG2靶细胞,通过检测EGFP的表达分析启动子的转录活性。本研究对长度分别为1.3kb和7.2kb的调控序列转录功能进行了比较,发现EGFP的表达并没有大的差异且荧光强度较弱,说明猪血清白蛋白基因在细胞水平控制转录的主要调控区分布在-1.3kb的范围内,而在-1.3kb~-7.2kb范围内的远端调控序列可能在细胞水平上对基因的表达增强作用不明显。另有研究表明,白蛋白的表达水平与其启动子的活性密切相关,而肝癌细胞系中的白蛋白表达水平只有正常肝脏细胞的5%~10%[7],因此白蛋白启动子在HepG2中的转录活性与体内正常肝细胞的活性并不完全相同,这也解释本实验中荧光强度较弱的原因。由于各种生理生化因素的作用,在动物体内其转录活性可能会高于在细胞水平上的表达,而且不同长度的调控序列其转录活性也有可能不同,对此仍需作进一步的深入研究。猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析@孙世惠$军事医学科学院生物工程研究所!北京100071 @周艳荣$军事医学科学院生物工程

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