FLT4基因在斑马鱼早期发育过程中的表达

作者:姜利军;周晓曦;于飞;黄亮;马全富;周剑锋;曹阳 刊名:现代生物医学进展 上传者:吴昌明

【摘要】目的:研究FLT4(VEGFR3)基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。方法:提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的FLT4RNA反义探针,WISH(整胚胎原位杂交)研究FLT4在斑马鱼早期发育过程中的表达。结果:成功合成FLT4基因探针,获得FLT4基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况:FlT4在2-cell、32-cell、oblong、shield期前普遍性表达(0.75h、1.7h、3.7h、6h);24h在头部表达较多,特别是在ICM(intermediate cell mass,中间细胞群)区处有特异性表达;48h、72h在头部表达均较高表达。结论:FLT4在早期参与了血管的形成和造血的发生,在脑部和肾小管的发育中可能起到了重要作用。

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前言在胎盘哺乳动物存在三个血管内皮生长因子(VEGF,vasc-ularendothelialgrowthfactor)同源基因受体家族,即FLT1(也称为VEGFR1),KDR(也命名为Flk1和VEGFR2)和FLT4(也称为VEGFR3)。FLT4(fmsliketyrosine4)存在于所有内皮细胞,在发育过程中,到成年时局限于淋巴内皮,其配体包括VEGF-C和VEGF-D。FLT-4,血管内皮生长因子受体,被其特异性配体VEGF-C激活,由此产生的信号转导通路促进血管和/或淋巴管生成。淋巴道转移是大多数肿瘤转移的重要途径之一,多项研究显示,FLT4在宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、鼻咽癌等[1-8]在癌组织中不同程度异常表达,并与临床肿瘤的分期、病理分级、肿瘤淋巴管的生成、评价预后等均有密切关系。FLT4可能成为临床肿瘤靶向治疗的潜在靶点。斑马鱼具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点,特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选。这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一。通过序列比对和进化树分析发现斑马鱼FLT4与小鼠、人的FLT4具有高度同源性。整胚胎原位杂交技术广泛运用于基因表达谱,是研究斑马鱼发育,探索相关基因的功能的重要手段[9]。本研究通过整胚胎原位杂交技术分析了FLT4在斑马鱼早期发育过程中的表达情况,为深入研究这一基因的功能提供了理论依据。1材料和方法1.1材料斑马鱼野生型(WT/AB),总RNA提取试剂盒、探针纯化回收试剂盒(Ambion公司),PCR引物、pbsk载体订购于上海英俊贸易有限公司,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(OMEGA公司),大肠杆菌DH5感受态细胞(Tiangen公司),普通质粒小提试剂盒(博大泰克公司),T4DNA连接酶、T3RNApolymerase(Fermentas公司),限制性内切酶KpnI、Xba(ITakara公司),DI-GRNALabelingMix、Anti-digoxigen-AP、染色剂:NBT和BCIP(Roche公司)。1.2方法1.2.1人、小鼠和斑马鱼的FLT4基因进化树分析从生物技术信息网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide)获取人、小鼠和斑马鱼FLT4的蛋白氨基酸序列,用ClustalX和Mega5软件进行构建系统进化树。1.2.2提取总RNA收集0.75、1.7、3.7、6、24、48小时的野生型斑马鱼胚胎,按照总RNA提取试剂盒kit说明进行操作,-70度进行保存。1.2.3RT-PCR将提取的总RNA用随机引物法进行反转录。根据斑马鱼FLT4基因mRNA序列,圈定CDS区,设计FLT4的探针引物:FLT4上游:5'GGGGTACCcaggatgagagcaccagaca3'(酶切位点KpnI),FLT4下游:5'GCTCTAGAggtctggcctgaga-gttgag3('带酶切位点XbaI),PCR产物大小为577bp。用cDNA模板扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增的目的片段。1.2.4载体的构建将回收纯化的PCR产物和PBSK载体进行双酶切,酶切位点为KpnI和XbaI,将酶切后的产物进行纯化,T4DNA连接酶连接,42度热激法转化到感受态DH5中,经氨苄抗性筛选重组质粒克隆。1.2.5菌落PCR、酶切鉴定和测序挑取单克隆进行进行小摇(37度摇床,250rpm/min,12到16小时),以菌液为模板进

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