基孔肯雅病毒包膜蛋白E2的全基因合成及原核表达

作者:章萍萍;潘卫;曹洁;陈秋莉;王锦红;张华群;葛宜兵;祁培培;刘超;邓松华 刊名:安徽医科大学学报 上传者:马楠

【摘要】目的通过对全长基孔肯雅病毒包膜蛋白E2(CHIKV-E2,1~404 aa)及其跨膜疏水区(351~378 aa)缺失突变体E2(1~350 aa)进行原核表达,分析跨膜疏水区对E2蛋白在大肠杆菌中表达的影响。方法利用ExPasy预测软件对E2蛋白跨膜疏水区进行预测分析,根据GenBank数据库中CHIKV-E2氨基酸序列获得其对应的基因序列。结合重叠延伸PCR(OE-PCR)原理设计用于全基因合成的核酸引物对CHIKV-E2全长基因(404 aa)进行体外合成,构建全长E2蛋白及其缺失突变体原核表达质粒,将序列正确的两种重组质粒分别转至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组质粒的表达情况。结果 OE-PCR法成功合成了大小为1 212 bp的编码CHIKV-E2(1~404 aa)蛋白的全长基因,构建了全长E2蛋白及其缺失突变体重组表达质粒pET21b-E2(1~404)和pET21b-E2(1~350),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示缺失突变体pET21b-E2(1~350)融合蛋白表达量较pET21b-E2(1~404)有明显提高。结论 E2蛋白跨膜疏水区(351~378 aa)对该蛋白的原核表达具有重要影响,缺失该疏水区的突变体在大肠杆菌中表达量比全长E2蛋白表达量明显提高。

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基孔肯雅病毒(chikungunyavirus,CHIKV)属于披膜病毒科的甲病毒属,由该病毒感染后引起的症状称之为“基孔肯雅热”。伊蚊是基孔肯雅热的主要传播媒介[1-2]。2008年香港发现首宗外地传入基孔肯雅病[3-4],2010年我国广东东莞发生基孔肯雅热聚集性疫情10例。目前尚无针对CHIKV的国家标准或行业标准检测方法。因此,建立CHIKV的快速检测方法并用于基孔肯雅病的检测工作,对防止该病传入我国有重要的意义。CHIKV基因组[1-3]为单链线形正股RNA,长约1200bp,可分为非结构区和结构区,编码病毒结构蛋白有衣壳蛋白C,外膜糖蛋白E1、E2、E3[5]。膜蛋白是一种嵌在生物膜中的蛋白质,发挥着重要的生物学功能,决定蛋白质结构类型和稳定性的一个最重要的因素是氨基酸序列的疏水性[6-8],由于膜蛋白特殊的环境决定了跨膜区必须由大约20个强疏水的氨基酸组成[9-10]。对基孔肯雅病毒包膜蛋白E2(CHIKV-E2)氨基酸序列通过ExPasy等软件预测出该蛋白在351378aa处存在着约28aa疏水性氨基酸组成的跨膜螺旋序列[11]。该研究就这一模拟预测结果分别构建了全长和截断跨膜区的两种原核表达质粒并在大肠杆菌表达系统中进行表达,验证了这一跨膜疏水区对蛋白表达的影响,同时也为后续CHIKV疫苗的研究提供了重要信息。1材料与方法1.1载体和菌株pMD18-T载体(T载体)购自TaKaRa公司;原核表达载体pET-21b(该表达载体蛋白包括由连续6个His组成的标签)及其宿主菌E.coliBL21(DE3)购自Novagen公司;E.coliDH5均由第二军医大学微生物学教研室保存。1.2试剂盒与工具酶DNA凝胶回收试剂盒、质粒小抽提试剂盒均购自上海生工生物有限公司;TaqDNA聚合酶购自上海申能博彩公司;限制性内切酶NdeI和XhoI,蛋白分子量Marker和DNA分子量MarkerDL2000,TA克隆试剂盒均购自TaKaRa公司;T4DNA连接酶(LigationHighkit)购自东洋纺(中国上海)生物科技有限公司。1.3引物设计与合成1.3.1全基因体外合成引物设计根据GenBank(GenBank:AF369024,S27Africanprototype)中CHIKV坦桑尼亚株序列以及大肠杆菌偏好密码子设计并合成了17对重叠互补引物用以体外合成[12-13]CHIIKV-E2DNA序列。上游核酸引物命名为F1、F2、F3…F17;下游核酸引物命名为R1、R2、R3…R17,每条引物长约54bp,引物之间重叠区域包含18个碱基,全基因序列全长404aa。1.3.2表达载体构建用引物设计根据已经获得的经大肠杆菌密码子优化后的CHIKV-E2(1404aa)序列,分别设计用于PCR扩增的上下游引物,同时在上游引物(U-E2)添加了NdeI的酶切位点(CATATG)和7个保护碱基。下游引物(D-E2)在末端添加XhoI的酶切位点(CTCGAG)和6个保护碱基。利用在线预测软件对E2蛋白跨膜疏水区进行预测分析,构建跨膜疏水区(351378aa)缺失突变体E2(1350aa)。为构建截短E2(1350aa)原核表达质粒,设计下游引物(DE2-350),在其末端添加XhoI酶切位点(CTCGAG)和6个保护碱基。以上所有引物采用PrimerPremier5.0软件分析评价,并且委托上海生工生物有限公司合成。具体引物序列见表1。1.4CHIKV-E2(1404aa)DNA的全基因合成、克隆及序列测定采用合成的17对重叠互补引物,利用重叠延伸

参考文献

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