增殖型糖尿病性视网膜病变动物模型的建立

作者:董白霞;马景学;叶存喜;包永琴;杨爱琴;休贺明 刊名:第三军医大学学报 上传者:赵建想

【摘要】目的建立模拟人类增殖型糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)的动物模型,并确证其价值。方法链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)60 mg/kg腹腔注射造成SD大鼠糖尿病模型1个月后行VEGF玻璃体注射制造增殖型糖尿病眼底病变模型(C组),观察造模后不同时间荧光素眼底血管造影(fluorescence fundus angiography,FFA)改变及有无CD105标记阳性的视网膜毛细血管内皮细胞,并与传统的非增殖型糖尿病眼底病变大鼠模型(B组)作比较。结果 FFA结果显示:正常组无1例观察到异常荧光;B组大鼠仅观察到背景荧光的增强;C组大鼠不仅出现了背景荧光增强、大血管扭曲和毛细血管扩张、视网膜血管荧光素渗漏、视网膜内出血等临床中常见的非增殖期病变,还观察到了视网膜新生血管这种增殖期糖尿病性视网膜病变特有的体征。光镜观察视网膜血管渗漏情况及免疫组化CD105标记视网膜内增殖的新生血管内皮细胞情况显示:正常组及B组大鼠无1例视网膜微血管碳素颗粒渗漏,CD105均为阴性;C1组(VEGF玻璃体注射后2周):仅观察到神经节细胞层大血管有碳素颗粒的渗漏,CD105阴性;C2组(VEGF玻璃体注射后4周):除C1组病变外,还可观察到外核层有渗漏至血管外的碳素颗粒,CD105阳性;C3组(VEGF玻璃体腔注射后8周):除C2组病变外,还可观察到黄斑区水肿、渗出等病理改变、广泛的微血管渗漏,CD105阳性。结论该动物模型成功地观察到视网膜新生血管,并与出现增殖内皮细胞的病程一致,经FFA及免疫组化CD105标记验证有很好的应用价值,并且周期短、更经济,为临床筛选药物研究提供了理想动物模型。

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近年来,糖尿病发病率日益升高,其并发症糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)严重威胁患者生存质量。如何早期治疗DR,提高DR患者的生存质量成为当前亟待解决的问题。以往研究热点主要集中于治疗药物筛选方面[1],但所用糖尿病动物模型均为非增殖期病变,而临床就诊患者绝大多数是增殖期患者,目前国内尚少有报道能够模拟人类增殖型DR的动物模型用于筛选药物研究来指导临床治疗。近年来已达成共识,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在DR的发生、发展过程中起了主导作用[2]。我们推测:是否可以在糖尿病动物模型的基础上玻璃体注射VEGF,寻求一种可模拟人类增殖期眼底病变、周期短的理想动物模型,以满足临床药物研究需要。因此,我们设计了如下实验:链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射联合VEGF玻璃体注射制造的DR模型(C组),并与既往非增殖期DR模型(B组)进行比较,试图建立增殖型糖尿病性视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy,PDR)模型用于药物研究,以增强临床药物试验对临床治疗的指导意义。1材料与方法1.1动物的来源、选择及分组选取8周龄健康SD大鼠44只,雌雄各半,体质量180250g。购自河北医科大学实验动物中心。44只鼠分为2组:糖尿病组:腹腔注射STZ(60mg/kg,用0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液溶解、浓度为10g/L),32只;1周后测血糖(美国强生血糖仪)13.9mmol/L确定为糖尿病鼠[3],之后每周测血糖1次,低于13.9mmol/L的大鼠淘汰出糖尿病组,成模24只,成模率为75%。正常组:腹腔注射等量的生理盐水,12只。糖尿病组24只鼠采用随机配伍组方法分为2组:C组:腹腔注射STZ后1个月时846复合麻醉剂(0.4ml/kg)肌肉注射全麻后0.05gVEGF(美国Sigma公司)双眼玻璃体注射,12只。B组:腹腔注射STZ后1个月时等量生理盐水双眼玻璃体注射,12只。1.2实验方法1.2.1眼底荧光血管造影(FFA)检查玻璃体注射VEGF后第2、4、7天,2周(C1、B1组),4周(C2、B2组),8周(C3、B3组)各选3只鼠846复合麻醉剂(0.4ml/kg)肌肉注射全麻后20%荧光素钠0.1ml腹腔注射,行双眼FFA检查,观察眼底病变程度。1.2.2视网膜组织病理学观察玻璃体注射VEGF后2、4、8周846复合麻醉剂(0.4ml/kg)肌肉注射全麻后每组各取3只动物(其余1只留做电镜标本),左侧颈动脉注射碳素墨汁后处死、摘除左眼球做组织切片,观察其视网膜微血管对碳素颗粒的渗漏程度;摘除右眼球做组织切片,行CD105免疫组织化学染色,观察有无增殖的新生血管内皮细胞。2结果2.1FFA造影结果正常组:无1例观察到异常荧光(图1A)。B组:2只鼠于注射VEGF后4周才观察到背景荧光的增强(图1B)。C组:2只鼠于注射VEGF后2dFFA可见背景荧光增强;1只鼠4d、另2只鼠2周可见视网膜内出血;2只鼠2d、另1只鼠2周发生了大血管扭曲和毛细血管扩张;1只鼠2周观察到血管荧光素渗漏、1只鼠4周观察到了视网膜新生血管(图1CD)。DABCA:正常SD大鼠FFA结果;B:B组大鼠STZ注射后4周背景荧光增强();C:C1组大鼠视网膜血管荧光素渗漏()和出血();D:C2组大鼠视网膜新生血管形成()图1各组大鼠FFA造影结果观察ABC荨A:外核层碳素颗粒渗漏HE染色观察(400):渗漏至视网膜血管外的碳

参考文献

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