转化生长因子β1通过Smad3调控补体应答基因32转录的分子机制

作者:沈云琳;钮小玲;刘华杰;孙蕾;匡新宇;黄文彦 刊名:《肾脏病与透析肾移植杂志》 上传者:姜艳姝

【摘要】目的:前期工作发现补体应答基因32(RGC-32)是转化生长因子β(TGF-β)诱导的肾小管上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中Smad信号下游的关键调控分子。本研究拟进一步明确TGF-β诱导肾小管EMT过程中RGC-32的转录调控机制。方法:体外培养NRK-52E细胞,利用荧光素酶报告基因实验检测RGC-32启动子活性以确定Smad结合元件(SBE)是否为TGF-β诱导的RGC-32转录调控位点;通过凝胶迁移率实验(EMSA)明确与之结合的转录调控分子。结果:(1)转染野生型SBE片段的NRK-52E细胞荧光素酶活性明显增高,而转染突变的SBE片段的细胞无此表现,表明SBE是调控TGF-β诱导的RGC-32转录启动的关键位点。(2)合成32P标记的包含SBE的寡核苷酸探针行EMSA可见TGF-β诱导的核蛋白与探针复合物生成,且加入包含SBE序列的竞争片段可以抑制此核蛋白-探针复合物的形成,表明有蛋白与SBE结合并调控RGC-32的转录。(3)当加入不同的Smad抗体行超迁移实验发现Smad2和Smad3抗体可以和复合物相互作用,表明Smad2和Smad3可能是TGF-β诱导的转录复合物的组成部分。(4)将Smad2和Smad3分别与p-1500RGCluc共同转染NRK-52E细胞,Smad3可以显著增加RGC-32启动子活性,表明Smad3是TGF-β诱导的转录复合物的组成部分,而不是Smad2。结论:在TGF-β诱导肾小管EMT过程中,Smad3通过与RGC-32启动子区SBE结合,从而调控肾小管EMT过程。

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肾脏病 与透析肾移植杂 志 第 24卷 第 5期 2015年 1O月 ·447 · 转化 生长 因子 p 1通过 Smad3调控补 体应 答基 因 32 转 录 的分子 机制 沈云琳 钮 小玲 刘华杰 孙 蕾 匡新宇 黄文彦 摘 要 目的 :前期工作发现补体应答基因 32(RGC.32)是转化生长因子 B(TGF—p)诱导的肾小管上皮细胞一 间充质转化(EMT)过程中 Smad信号下游的关键调控分子。本研究拟进一步明确 TGF—B诱导肾小管 EMT过程中 RGC一32的转录调控机制。 方 法 :体外培养 NRK一52E细胞 ,利用荧光素酶报告基因实验检测 RGC.32启动子活 性以确定 Smad结合元件(SBE)是否为 TGF—p诱导的 RGC一32转录调控位点;通过凝胶迁移率实验(EMSA)明确与 之结合的转录调控分子。 结果 :(1)转染野生型 SBE片段的 NRK.52E细胞荧光素酶活性明显增高,而转染突变 的 SBE片段的细胞无此表现,表明 SBE是调控TGF-B诱导的RGC一32转录启动的关键位点。(2)合成 P标记的包 含 SBE的寡核苷酸探针行 EMSA可见 TGF—B诱导的核蛋白与探针复合物生成,且加入包含 SBE序列的竞争片段 可以抑制此核蛋白一探针复合物的形成 ,表明有蛋白与 SBE结合并调控 RGC 32的转录。(3)当加入不同的 Smad 抗体行超迁移实验发现 Smad2和 Smad3抗体可以和复合物相互作用 ,表明 Smad2和 Smad3可能是 TGF.B诱导的 转录复合物的组成部分。(4)将 Smad2和 Smad3分别与 p-1500RGCluc共同转染 NRK一52E细胞 ,Smad3可以显著增 加 RGC一32启动子活性,表明Smad3是 TGF—B诱导的转录复合物的组成部分 ,而不是 Smad2。 结论 :在 TGF—B诱 导肾小管 EMT过程中,Smad3通过与 RGC一32启动子区 SBE结合,从而调控肾小管 EMT过程。 关键词 补体应答基因 32 上皮一间充质转化 转化生长因子 B 转录调控 The molecular mechanism of TGF- 1 regulating trascription of response gene to com plem ent 32 through Smad3 pathways SHEN Yunlin,NIUXiaoling,LIUHnafie,SUN Lei,KUANGXinyu,HUANG Wenyan Department of Nephrology and Rheumatology,Shanghai Children's Hospital,Shanghai Jiao University,Shanghai 200062,China Corresponding author:HUANG Wenyan(E—mail:hwy65@hotmail.corn) ABSTRACT 0bjective:To research the molecular mechanisms of Smad3 regulation RGC一32 transcirption in TGF— t3 1 induced Epithelial—mesenchymal Transition on NRK一52E Cells. Methodology:The NRK一52E cells were cuhured and transiently transfected in vitro.Luci

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