Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的检测及其对预后的影响

作者:汤睿;王兵;唐思聪;刘炳亚;朱正纲 刊名:外科理论与实践 上传者:刘汉强

【摘要】目的:探讨Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的检测和淋巴结微转移对预后的影响。方法:于前瞻性研究31例行根治性手术的Dukes A、B期大肠癌病人,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测所清除的398枚淋巴结中细胞角蛋白(cytokeratin,CK)20 mRNA的表达以检出微转移;经5年以上的随访,探讨淋巴结微转移对预后的影响和术后复发的可能原因。结果:在31例Dukes A、B期大肠癌病人的398枚淋巴结中,有15例(48.39%)共46枚(11.56%)淋巴结检出微转移。单因素分析提示微转移的淋巴结数量、位置及肿瘤生长方式与术后复发有关;Logistic多元回归模型提示,3枚以上淋巴结发生微转移与复发紧密联系。结论:CK20 RT-PCR是检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移灵敏而特异的方法。3枚以上淋巴结发现微转移是预示复发的独立因素。

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淋巴结转移状况是判断大肠癌病人预后和指导术后化疗的重要指标[1,2]。常规的病理组织学检查在敏感性等许多方面存在不足,近年通过连续切片、免疫组化和逆转录聚合酶链反应(PT-RCR)等方法均可在部分苏木精-伊红(HE)染色阴性的淋巴结中检出微小转移[1]。笔者既往也曾应用RT-PCR法进行大肠癌淋巴结转移的检测,结果发现RT-PCR法检出淋巴结转移的敏感性高于HE染色,并能检出HE阴性淋巴结中的微转移灶[3]。DukesA、B期是指HE检查未发现淋巴结转移者,预后相对较好,但其中仍有10%25%的病人在术后5年内出现复发[2]。因此本研究针对DukesA、B期病人,仍采用RT-PCR法检测淋巴结微转移,并探讨淋巴结微转移的发生对预后的影响。材料与方法一、病例资料和标本采集前瞻性研究。所有病例均为1999年112月入我院普外科,实验终止于2004年12月。入组条件:行根治性手术的大肠癌病人,经术后常规病理检查分期为DukesA、B期;术前无放、化疗史。术后定期检查随访,随访期均超过5年,排除失访者和因其他病因导致死亡的病例。至实验终止共收集31例病人。术后总随访期为6070个月,期间记录病人的复发情况,死亡病人的生存期为手术至肿瘤转移复发死亡的时间,存活病人的生存期为手术至研究终止的实际时间。31例大肠癌病人中男17例,女14例;年龄3280岁,平均(60.213.7)岁。结肠癌18例,直肠癌13例;DukesA期5例,DukesB期26例;肿瘤超过肠腔周径1/2者11例,未超过者20例;肿瘤呈膨胀型生长14例,浸润型生长17例;病理检查分化好5例,中等分化18例,分化差8例。手术切除的标本立即分离淋巴结并取一小块肿瘤组织,每枚淋巴结纵行切开,一半做常规病理切片HE染色,另一半与肿瘤组织液氮冻存直至RNA抽提。淋巴结总数为398枚,平均每例病人(14.76.3)枚。此外,取2例良性胃肠道病变的15枚淋巴结(1例胃溃疡病人10枚,1例直肠腺瘤病人5枚)作为阴性对照;取2例DukesC期大肠癌病人的8枚HE染色阳性淋巴结作为阳性对照。二、RT-PCR检测方法本实验采用RT-PCR法定性检测淋巴结中细胞角蛋白(CK)20mRNA的表达,同时选择管家基因GAPDH作为内参证明抽提RNA的完整性。Trizol试剂(华舜公司产品)抽提组织总RNA(具体步骤详见操作手册),取部分RNA样品稀释后测光密度(OD)值,OD260/OD280为1.82.0,并换算浓度。采用AccessRT-PCR试剂盒(Promega),逆转录和PCR在同一试管、单一缓冲液中完成。每个RNA样品分别用CK20和GAPDH引物进行RT-PCR反应。反应体系25l,含5缓冲液5l(终浓度为1),dNTP0.5l(终浓度0.2mM),上游和下游引物各0.5l(终浓度1M),25mMMgSO41l(终浓度1mM),AMV逆转录酶、TflDNA合成酶各0.5l(终浓度0.1M/l)和1g总RNA。加样完成后,轻微振荡混匀,放入PTC-100TM热循环仪(MJResearch)。首先48、45min进行逆转录(cDNA第1链合成),然后94、2min使AMV酶失活并使RNA/cDNA/引物变性,以后按以下条件合成cDNA第2链和进行PCR扩增。CK20引物存在时反应条件为941min、622min、682min共40次循环;GAPDH引物存在时为941min、631min、682min共30次循环,最后687min。引物序列如下:CK20,正义:5-CAGACACACGGTGAACTATGG-3,

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