PAI-1过表达促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移

作者:王迪;杨荔艳;刘奏;余竟;张敏杰;张钰;蔡岩;徐昕;郝佳洁;王明荣 刊名:遗传 上传者:杨振山

【摘要】食管癌是常见的恶性肿瘤之一;由SERPINE1基因编码的纤溶酶原激活物抑制因子1(plasminogenactivatorinhibitor-1;PAI-1)已被报道在多种类型癌症患者的肿瘤组织中存在高表达并参与癌症进展;为探讨PAI-1蛋白在食管鳞癌中的作用及其分子机制;本研究首先利用Westernblot实验和酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay;ELISA)检测各食管鳞癌细胞系中PAI-1的表达和分泌水平;结果显示;PAI-1高表达的食管鳞癌细胞系分泌至细胞外的PAI-1水平相对较高;进一步选取PAI-1表达及分泌水平均较高的KYSE150和KYSE450细胞系作为研究模型;通过siRNA(小干扰RNA)瞬时转染和Transwell实验证实敲降SERPINE1可显著抑制食管鳞癌KYSE150和KYSE450细胞的侵袭和迁移;同时;构建了慢病毒介导的SERPINE1稳定敲降细胞株KYSE150和KYSE450;将SERPINE1稳定敲降的细胞培养基中外源加入PAI-1蛋白进行Transwell回复实验;结果表明PAI-1过表达可增强食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力;体内实验结果显示;降低PAI-1表达可显著抑制食管鳞癌细胞的成瘤和肺转移能力;分子水平检测表明PAI-1过表达可激活AKT和ERK信号通路;免疫共沉淀(co-immunoprecipitation;Co-IP)实验结果进一步显示PAI-1可能与膜受体LRP1(LDLreceptorrelatedprotein1)存在相互作用;上述研究结果表明;PAI-1可能通过与LRP1相互作用进而促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移;

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食管癌是常见的恶性肿瘤之一,死亡率位居我国恶性肿瘤死因的第4位[1]。根据病理类型不同,食管癌可分为鳞癌和腺癌两种亚型。在中国,食管癌的主要病理类型为鳞癌[2]。肿瘤复发和转移是导致患者预后较差的重要原因。因此,深入研究食管癌侵袭和转移的分子机制,将有助于改善食管癌的治疗进而提高患者的生存率。由SERPINE1基因编码的PAI-1蛋白属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员,是组织型纤溶酶原激活物t PA和尿激酶型纤溶酶原激活物u PA的主要抑制因子,具有抑制纤维蛋白溶解的功能[3]。PAI-1可以促进膀胱移行癌细胞增殖[4]、三阴性乳腺癌细胞侵袭迁移[5,6]、以及非小细胞肺癌和胃癌的转移[7,8],进而促进癌症进展。Sakakibara等[9]研究表明在转移性食管鳞癌患者的肿瘤组织中PAI-1表达升高,且PAI-1高表达的患者生存率较低,提示其可能作为判断食管鳞癌预后的标志物。然而,PAI-1在食管癌中的作用及其分子机制尚不清楚。本研究分析了PAI-1在各食管鳞癌细胞系中的表达以及分泌情况,利用基因敲降技术在PAI-1高表达细胞系中降低PAI-1的表达,然后向培养基中外源加入PAI-1蛋白,通过Transwell实验检测PAI-1对于食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力的影响,发现食管鳞癌细胞自分泌的PAI-1可以增强细胞侵袭迁移能力。裸鼠体内移植瘤实验和肺转移实验表明,PAI-1能够促进食管癌的生存和转移。通过对分子机制的研究,发现PAI-1能够激活AKT和ERK信号通路,进一步研究表明LRP1是PAI-1促进食管鳞癌细胞侵袭迁移的关键分子。本研究初步揭示了PAI-1在食管癌中的作用机制,为食管癌提供了潜在的治疗靶点。1材料与方法1.1细胞培养食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、 KYSE150、KYSE450和KYSE510细胞为日本东京大学Shimada教授惠赠,使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,于CO2培养箱中37℃培养。人胚肾细胞293FT购自美国Invitrogen公司,使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,于CO2培养箱中37℃培养。1.2慢病毒包装及靶细胞感染慢病毒干扰载体p LKO.1 puro (#8453)、慢病毒包装质粒ps PAX2 (#12260)、p MD2G (#12259)均购自美国Addgene公司。干扰SERPINE1基因表达的慢病毒包装时,在生长于6 cm皿中密度为80%左右的293FT细胞中,加入含18μL lipofectamine 2000、6μg p LKO.1、3μg ps PAX2、3μg p MD2G的Opti-MEM溶液,6 h后更换为完全培养基培养,48 h后收集上清,用0.45μm滤膜过滤,分装,保存于-80℃冰箱。感染靶细胞时,将0.5 m L病毒上清加入六孔板中密度为50%左右的靶细胞中,并按照1∶1000 (体积比)加入8 mg/m L polybrene,培养24 h后更换为完全培养基,利用0.9μg/m L嘌呤霉素进行筛选。干扰SERPINE1表达的慢病毒sh RNA (sh SERPINE1)序列为5?-GCCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGT TTTT-3?,由上海生工生物工程股份有限公司合成。1.3 si RNA转染细胞接种至六孔板中,待密度约为30%时进行转染,将5μL si RNA和Lipofectamine 2000分别溶于250μL Opti-MEM中,摇匀,室温孵育5

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