烟草甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析

作者:林世锋;任学良;王仁刚 刊名:贵州农业科学 上传者:王晓猛

【摘要】为了对植物抗病虫基因工程研究提供依据,以辣椒凝集素基因为探针,通过电子克隆方法从烟草栽培品种K326中克隆甘露糖结合凝集素基因,并对其进行了序列分析。结果表明:从烟草栽培品种K326中克隆出NtMBL1、NtMBL2和NtMBL33种甘露糖结合凝集素基因;3种凝集素cDNA序列均包含完整的开放读码框,编码298个氨基酸,具备B-凝集素结构域,与辣椒凝集素蛋白的一致性较高。经SWISS-MODEL同源模建分析,NtMBL1、NtMBL2和NtMBL3的蛋白模型由8~9个β片层组成的β桶结构,具有与单子叶植物甘露糖结合凝集素相似的空间结构。

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植物凝集素是一类含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质[1]。单子叶植物甘露糖结合型凝集素(Monocotmannose-bindinglectinsMBL)是其中比较大的一个家族。其中,以雪花莲凝集素为代表的一个亚类显示出良好的抗同翅目昆虫活性,以天麻抗真菌蛋白为代表的另一亚类则具有突出的抗真菌活性,它们在植物抗虫和抗病基因工程中均具有很大的应用潜力。关于甘露糖结合凝集素的抗虫研究报道较多,而在抗病方面的研究报道则相对较少。从天麻中分离得到的天麻抗真菌蛋白GAFP,属于单子叶植物甘露糖结合凝集素家族成员,对一些真菌有明显抗性[2-3]。辣椒(Capsicumannuum)和烟草(Nicotianataba-cum)均属于茄科植物,从该植物中克隆到的甘露糖结合凝集素基因(CaMBL1)在辣椒细胞程序性死亡和抗病性方面具有重要作用[4],推测烟草凝集素也可能有抗病作用。目前为止,还没有从烟草中克隆凝集素基因的报道。笔者等根据烟草与辣椒同属茄科植物,物种间同源基因序列相对保守这一特性,以辣椒凝集素CaMBL1基因cDNA序列为探针,通过电子克隆方法获得烟草栽培品种K326(N.tobac-cumK326)的3种甘露糖结合凝集素基因并进行生物信息学分析,以期为该类基因的进一步研究和植物抗病虫基因工程研究提供依据。1数据来源与研究方法1.1数据来源生物信息学数据库的美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)提供并维护的BLAST数据库中的EST数据(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。1.2研究方法1.2.1烟草凝集素基因的电子克隆以辣椒凝集素CaMBL1基因的全长cDNA序列(GenBank登陆号:GQ265892)[4]为信息探针,对GenBank中EST_others数据库指定物种烟草(Nicotianatabacum)进行BLAST检索,将检索到的烟草栽培品种K326的全部EST序列利用DNAMAN6.0软件进行拼接,形成重叠群(contig)。然后用此重叠群再次进行同源检索、拼接,重复以上过程直至没有更多烟草栽培品种K326的重叠EST检出,最终获得烟草栽培品种K326凝集素cDNA序列片段。再以此片段在GenBank中进行blastx同源搜索,与其他物种的凝集素同源蛋白进行序列比较,进而判断拼接得到的烟草凝集素基因cDNA的正确性以及其ORF序列的完整性。1.2.2烟草凝集素基因的生物信息学分析利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的ORFfinder软件对开放阅读框进行分析并翻译成蛋白质,通过BlastP程序进行序列相似性分析和氨基酸保守性预测;运用DNAMAN6.0软件进行氨基酸序列的多重比对;利用瑞士生物信息研究所网站(http://www.expasy.org/tools/)提供的ProtParam软件和SignalP软件进行蛋白的基本特性和信号肽分析,通过SOPMA软件[5]和WISS-MODEL软件[6-7]对蛋白质的二级和三级结构进行预测。2结果与分析2.1烟草凝集素基因的电子克隆及结构特征利用已知的辣椒凝集素基因的核苷酸序列对GenBank中烟草EST数据库进行tBlastx同源性检索分析发现,9条相似性高的EST序列来自烟草品种K326。对其进行重叠群分析显示,9条EST可拼接成3个独立的cDNA序列,长度为1171bp、1069bp和1135bp,代表烟

参考文献

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