维生素E对神经细胞氧化应激损伤的保护作用

作者:马丽君;曹池;田建英;李宁康 刊名:宁夏医科大学学报 上传者:郝瑞城

【摘要】目的探讨维生素E对FeSO4和H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤模型的保护作用及其可能的机制。方法采用FeSO4和H2O2作用产生自由基的方法诱导建立PC12细胞氧化应激损伤模型。MTT比色法测定细胞活性,硫代巴比妥酸法测定MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力,免疫细胞化学法测定α7烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)阳性表达及dot blot法测定α7nAchR亚单位水平。结果与FeSO4和H2O2损伤组(0.136±0.015)进行比较,维生素E组(0.178±0.025)和EGCG组(0.181±0.029)均能明显提高PC12细胞的活细胞数量(P<0.01),提高SOD活力(15.29±0.79)U.mL-1对(17.37±0.76)U.mL-1、(17.90±0.44)U.mL-1,P<0.01,有效降低MDA的含量(4.51±0.20)mmol.L-1对(3.39±0.11)mmol.L-1、(3.20±0.15)mmol.L-1,P<0.01,明显上调α7nAChR的表达(0.0910±0.0272)对(0.1895±0.0392)、(0.1956±0.0322),P<0.01。结论维生素E对FeSO4和H2O2诱导建立PC12细胞氧化损伤模型具有明显的保护作用,其作用机制可能与维生素E清除自由基,抑制脂质过氧化过程和保护α7nAchR有关。

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在神经系统疾病的发生中,氧化应激是重要的致病因素,维生素E又称生育酚,主要存在于细胞线粒体膜和内质网上,酚性羟基可将活泼的H原子给予自由基,变成稳定的生育醌。研究表明VitE是抗氧化剂,可保护神经元免受氧自由基的损害,减缓阿尔茨海默病(AD)的病程[1],而有关VitE对7nAchR表达的影响近年尚未见报道。本实验以PC12为神经细胞模型,7nAchR为靶点探讨VitE预处理细胞,观察其对神经细胞的保护作用。1材料与方法1.1细胞和试剂PC12细胞购于中国科学院上海细胞生物研究所。兔抗人7多克隆抗体(SantaCruz),S-P试剂盒(福州迈新生物工程有限公司),丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、钙离子测定试剂盒(南京建成生物化学有限公司),DAB染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);30%H2O2分析纯,天津华东试剂厂(批号2008221);FeSO4(FerrousSulphate),批号111613-200301;表没食子儿茶酚没食子酸酯(EGCG)纯度>95%;VitaminE(VitE)纯度98.8%,批号100062-200608,均购于中国药品生物制品鉴定所。1.2仪器550型酶标仪(BIO-RAD),Moticim-agesadvanced3.2图像分析系统。1.3方法1.3.1细胞培养与实验分组PC12细胞,用10%小牛血清,青-链霉素各10万单位的DMEM培养基在375%CO2培养箱中培养,3d半量换液1次。细胞进入对数生长期时,以1104mL-1密度接种于96孔板中。实验分为六组:对照组(control组);FeSO4和H2O2损伤组(FR);VitE组;EGCG组;VitE+FR组;EGCG+FR组。第3天开始,control组换10%小牛血清的DMEM培养基,实验组分别加入20molL-1EGCG和20molL-1VitE于375%CO2培养箱中预先孵育24h,加入终浓度为100molL-1FeSO4和50molL-1H2O2进行损伤处理。24h后观察各检测指标。1.3.2MTT法测定PC12细胞活性终止反应前4h,每孔加入10L的5gL-1MTT,吸弃培养液,每孔加入100L的二甲基亚砜(DMSO)振荡10min,于酶联免疫监测仪上检测各孔的吸光度(A490nm)。1.3.3SOD、MDA检测方法取细胞培养液,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力;TBA法测定MDA含量。1.3.4PC12细胞7nAchR的阳性表达细胞进入对数生长期时,以4104mL-1密度接种于24孔板中,24h后取出盖玻片进行免疫组化染色,一抗兔抗人7多克隆抗体(1150稀释),阴性对照加PBS液;光镜下进行形态学观察,阳性表达为细胞膜着色,显示为棕色。结果分析方法:采用Moticimagesadvanced3.2图像分析系统,每组6张,每张连续选取3个视野,进行统计分析,结果以7nAChR表示。1.3.5BCA蛋白检测法进行蛋白定量BCA蛋白浓度测定试剂盒:稀释标准品,将待测样品分别加入96孔板中,37孵箱作用30min,检测其吸光值(A),检测波长为562nm,根据标准曲线计算不同样品组细胞总蛋白的含量。1.3.6Dot-Blot检测7nAChR亚单位蛋白水平取定量后(2gmL-1)的细胞蛋白样品点膜,PBS洗膜Tween-200封闭,,将膜放入稀释的兔抗人7多克隆抗体(1500)中,4过夜。洗膜3次,加入HRP标记的二抗,DAB显色5min,膜片自然晾干,扫描后进行灰度分析。1.4统计学方法

参考文献

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