铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化

作者:赵瑞强;高燕会;章晓玲;斯金平 刊名:核农学报 上传者:周淑芬

【摘要】采用正交设计和单因素试验相结合的方法,对铁皮石斛的SCoT-PCR反应中5个因素(DNA模板、Mg2+、dNTPs、Taq酶和引物)进行优化试验。建立了适合铁皮石斛既稳定且多态性高的SCoT-PCR的最佳反应体:20μl PCR反应体系中含有1×Buffer、30ng DNA模板、2.5mmol.L-1Mg2+、0.15mmol.L-1dNTPs、1.5U Taq DNA聚合酶和0.4μmol.L-1引物。对铁皮石斛的SCoT-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现本试验引物S6的退火温度为54.5℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的SCoT-PCR反应体系在32份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和重复性。该优化的SCoT-PCR反应体系为进一步进行铁皮石斛种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析奠定了技术基础。

全文阅读

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)是我国传统名贵中药材,具有益胃生津、滋阴清热等功4期铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化效。因其独特功效被古人列为中华九大仙草之首,民间则称之为救命仙草。现代药理研究证明,铁皮石斛具有增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症等作用,特别是对人体肺癌细胞的抑制率高达74.7%97.2%[1,2]。近年来,由于生态破坏和过度开采,野生铁皮石斛已濒临灭绝。随着市场需求加大,人工种植铁皮石斛规模也不断扩大。铁皮石斛保健品和药品的大规模开发也导致了铁皮石斛混淆品的泛滥。因此,亟须建立有效的铁皮石斛种质鉴别的可靠手段[3]。近年来,分子标记发展迅速,已应用于石斛属植物的品种鉴定和真伪鉴别,如张铭等[4]利用RAPD标记技术对石斛属的26个种和金石斛属的1个种进行了基因组DNA多态性分析;白音等[5]利用AFLP标记技术对我国38种石斛进行研究,把铁皮石斛与其他37种石斛属植物区别开;Yue等[6]从研究的42个商业石斛杂交品种中开发了14个SSR多态性标记,并将其用于石斛品种的鉴定。但由于RAPD标记的不稳定性、AFLP标记的昂贵和费时、以及SSR标记难开发等,因此需要开发更好的分子标记应用于铁皮石斛的遗传多样性和亲缘关系、分子标记辅助育种、真伪鉴别及遗传改良。目标起始密码子多态性(startcodontargetedpolymorphism,SCoT)标记是Collard和Mackill[7]从水稻上提出的一种基于单引物扩增反应(singleprimeramplificationreaction,SPAR)的新型分子标记,是一种新的目的基因分子标记,其根据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性,设计单引物并对基因组进行扩增,产生偏向候选功能基因区显性多态性标记,且操作简单、多态性丰富,已成功应用于甘蔗[8]、柑橘[9]、龙眼[10]等园艺植物的辅助育种。为此,本研究以铁皮石斛为试材,建立适宜的SCoT标记技术体系,并将该体系应用于铁皮石斛的品种鉴定、真伪鉴别和种质资源的遗传多样性评价,以期为铁皮石斛的遗传多样性和亲缘关系、分子标记辅助育种、真伪鉴别及遗传改良提供新的理论和技术支持。1材料和方法1.1材料试验用铁皮石斛收集于浙江、云南、湖南、安徽、江西等5省20多个县(市),包括野生种质、农家品种共140余份,经斯金平教授鉴定为铁皮石斛,全部育种资源均保存于浙江农林大学遗传学科种质资源圃,取铁皮石斛幼嫩叶片保存于-70冰箱备用。1.2方法1.2.1铁皮石斛基因组DNA提取与检测铁皮石斛基因组DNA提取方法参照郑泉等[12]CTAB方法,稍有改进,所提DNA用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白仪U-008OD测定其质量和浓度,于-20冰箱保存备用。1.2.2SCoT-PCR扩增SCoT引物S6(CAACA-ATGGCTACCACGC)(参照Collard和Mackill[7]的方法设计),由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,PCR扩增采用20l体系,反应程序为:94预变性5min;94变性35s,51退火35s,72复性1.5min,35个循环;最后72延伸10min。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后[13]于GeneGeniusBioImagingSystem(BioRad)凝胶成像系统观察拍照。1.2.3正交试验设计以铁皮石斛DNA为模板,采用正交试验设计方法对影响PCR反应的5因素(DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶)设置4个不同水平(表1),采用L16(45)正交

参考文献

引证文献

问答

我要提问