黄芪多糖对斑马鱼发育及与衰老相关基因表达的影响

作者:夏广清;韩晓娟 刊名:中国药学杂志 上传者:刘芳[1]

【摘要】目的研究黄芪多糖抗衰老的作用机制。方法β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)及吖啶橙(AO)的荧光染色分析黄芪多糖对斑马鱼胚胎细胞衰老及凋亡的影响;RT-PCR检测与衰老相关基因的表达。结果当黄芪多糖质量浓度为0.25 mg.mL-1时,可以延缓斑马鱼细胞凋亡;增强斑马鱼端粒酶基因(TERT)基因的表达,降低bax、p21、p53基因的表达。结论黄芪多糖具有改善细胞复制性衰老的作用,其分子机制可能与上调TERT和下调p21、p53和bax基因的表达,从而起到一定的抗衰老作用。

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近年来延缓衰老以及老年病的预防已经成为国内外研究的焦点,寻找有效地抗衰老药物是衰老研究中的一个重要方面,由于化学药物的广泛使用及其毒副作用,研究的方向已瞩目于传统中药[1]。黄芪是最常用的“扶正固本,补中益气”中药之一,黄芪多糖(astragalinpolyose)为黄芪的主要成分,大量药理及临床实验结果表明,黄芪多糖具有抗衰老活性[2-4]。斑马鱼繁殖能力强,适于大规模诱变育种,其体外受精和胚胎透明的特点使其便于观察,因此,斑马鱼作为新型模式动物的优势正在逐渐被人们所认识,它在遗传学,发育生物学的研究中已被越来越广泛的应用[5]。在国际上,斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入生命体的多种系统(例如神经系统、心血管系统、免疫系统等)的发育、功能和疾病(例如神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等)的研究中,并已用于小分子化合物的规模新药筛选[6]。因此本实验以斑马鱼为实验材料,观察了黄芪多糖不同浓度对其生长发育及与衰老相关基因表达的影响,为黄芪多糖抗衰老提供理论依据。1材料与方法1.1材料野生型斑马鱼由中国海洋大学生命科学院提供,在处理的前一天,将雌雄斑马鱼雌雄进行分离,并与第二天上午进行交配后收集鱼卵,并在28条件下培养,取孵育8h发育正常的斑马鱼幼胚置于24微孔板中,每一微孔板15只斑马鱼幼胚,设置3次重复,每一处理分别设置空白对照组、黄芪多糖低(0.125mgmL-1)、中(0.25mgmL-1)、高(0.5mgmL-1)浓度进行处理,每1天更换1次培养液,连续处理3d,搜集样品,进行染色及基因表达分析。1.2药物及试剂黄芪多糖纯样品(陕西昂盛生物医药科技有限公司),Trizol、RT-PCR试剂盒(大连宝生物有限公司),-半乳糖苷酶及吖啶(Sigma公司)。将10mg黄芪多糖溶于1mL孵育鱼卵用的水溶液中(eggwater),制成10mgmL-1储存液,4保存。1.3样品的采集与处理取孵育8h发育正常的斑马鱼进行药物处理,1039中国药学杂志2012年7月第47卷第13期ChinPharmJ,2012July,Vol.47No.13每一处理浓度10个样品,3次重复,连续处理3d,光学显微镜下观察鱼的生长发育状态。1.4样品的SA--gal染色分析取连续处理3d发育正常的斑马鱼样品,PBS洗35次,4%paraformal-dehyde(PFA)4固定13d;PBS洗34次后PBS保存13d;然后PBS洗1次,加入染色液(25LmL-1)37培养1624h观察照相。1.5样品丫啶橙染色法(AO)染色分析取处理3d的样品,放置在含200gmL-1的AO的溶液中。30条件下培养30min,然后用孵育鱼卵水溶液洗8次,每次5min后,进行观察照相。1.6样品RT-PCR检测分析取3d的样品,PBS洗1次,然后彻底去除PBS,放入液氮中处理5min,放入-80冰箱中待用。1.7样品RNA的提取从-80冰箱取出待检测样品,Trizol法提取总RNA,取2g总RNA为模板反转录成cDNA。取2L反转录产物以-actin为内参照进行PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果、照相,用凝胶分析图像系统进行结果分析,分别计算各实验组条带的光密度与相对的-actin条带光密度的比值。本实验所用引物序列见参考文献[7-8]。2实验结果与分析2.1黄芪多糖对斑马鱼生长发育的影响给药处理24h后,统计了各处理对斑马鱼存活的影响,结果表明,黄芪多糖在0.1250.25mgmL-1对斑马鱼的发育影响不大,但当黄芪多糖浓度高于0.5mgmL-1时,斑马鱼的生

参考文献

引证文献

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