bFGF对神经细胞缺氧损伤的保护作用

作者:蒋波逸 刊名:中国社区医师(医学专业) 上传者:黄晓

【摘要】目的:观察不同浓度神经生长因子(bFGF)对大鼠胚胎中脑神经细胞缺氧损伤的保护作用。方法:建立原代培养神经细胞缺氧损伤模型,通过形态学观察以及细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)释放量、细胞内SOD活性、MDA含量的测定,研究bFGF对神经细胞缺氧损伤的保护作用。结果:bFGF能明显改善缺氧损伤神经细胞的形态改变,提高细胞存活率,减少细胞内LDH的漏出,并可显著提高细胞内SOD活性,减少脂质过氧化产物MDA的产生。结论:bFGF对神经元缺氧损伤具有明显的保护作用。

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碱性成纤维生长因子(bFGF)是一种多功能的非特异性活性物质,对内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经组织的修复、神经突起的生长以及胚胎的发育与分化等多种中胚层和神经外胚来源的细胞有促进促细胞分裂作用[1-3]。目前,临床治疗缺血性脑血管病尚缺乏积极有效的治疗手段,如果bFGF对于缺血后脑组织和细胞缺氧过程的保护和修复作用得到全面了解,将为临床治疗缺血性脑血管病及细胞缺氧开辟一条新的道路。本研究旨在探讨bFGF对大鼠中脑神经细胞缺氧损伤的保护作用。资料与方法实验动物:14天胚胎大鼠,体重250300g(江苏大学实验动物中心提供)。主要试剂和仪器:小牛血清(杭州四季青生物公司);DMEM培养基(美国Sig-ma公司);bFGF(Sigma,USA)基因重组bFGF由暨南大学生物工程研究所提供(纯度>95%);MTT(3-[4,5-二甲基磺胺噻唑]-2,5二苯基四唑溴蓝);乳酸脱氢酶(LDH);超氧化物歧化酶(SOD);丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所);上海西唐生物科技有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯。CO2培养箱(FormaScientic,USA);ELx800酶标仪(美国BIO-TEK公司)。胚胎中脑神经细胞的制备:用脱颈椎法处死妊娠14天孕鼠,在无菌条件下分离出胎鼠中脑,浸入37的胎牛血清。Hanks平衡液(1:1v/v)510分钟,用Hanks液漂洗3次后,用0.25%胰蛋白酶消化10分钟,加入小牛血清终止消化后经200目钢丝网筛过滤,离心洗去胰蛋白酶。加入DMEM培养液(内含50U/ml的青霉素,50g/ml的链霉素和15%小牛血清)制备细胞悬液,计数细胞存活率,采用台盼蓝计数活细胞。结果活细胞率94%,再用含10%小牛血清的DMEM培养基将细胞密度调整至3105个细胞/ml的细胞,将细胞悬液接种于培养板中,置37、5%CO2、95%空气饱和湿度培养箱中培养,细胞培养24小时后进行后续试验。胚胎中脑神经细胞缺氧损伤模型的建立:取培养24小时的神经细胞,用15%胎牛血清DMEM培养基连续培养,(预先充入95%N2-5%CO2混合气和30分钟),而后迅速将培养细胞移入同种95%N25%CO2混合气平衡过的单向气流缺氧装置,测氧仪监测排气口氧浓度(<1%),于37电热恒温培养箱中缺氧6小时后进行MTT实验及生化指标的测定。实验分组:将胚胎中脑神经细胞分组正常对照组、缺氧损伤模型组、bFGF干预组(浓度分别为10、25、50、100g/L)。MTT法检测神经元细胞存活率:以3105个细胞/ml的细胞接种于96孔培养板的神经细胞,缺氧损伤模型组及bF-GF干预组缺氧处理24小时,正常对照组37、5%CO2培养箱同步孵育,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20l,37继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养液,每孔加入150lDMSO,振荡10分钟,于酶标仪波长490nm处测吸光度值。每实验组设6个复孔。细胞外LDH活性的测定:接种于24孔板的神经元,缺氧损伤模型组及bFGF干预组缺氧处理24小时,正常对照组37、5%CO2培养箱同步孵育,取各组细胞培养上清液200l,用比色法测定LDH的活力,具体检测过程及操作方法参见试剂盒说明书进行。细胞内SOD活性、MDA含量测定:接种于24孔板的神经元,各实验组处理同上,0.25%胰酶消化,血清中止,离心1000r/分,10分钟,0.01mol/LPBS1ml溶解沉淀制成细胞悬液,细胞超声仪粉碎,超声时间5秒,间隔时间10秒,连续20次。用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活性;用硫代巴比妥

参考文献

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