三甲双酮对斑马鱼胚胎早期发育的影响

作者:秦伟;胡占英;佟军威;孟杰;游雪甫;张靖溥 刊名:遗传 上传者:郑金聪

【摘要】针对抗癫痫药物的临床神经性毒副作用及致畸性,以三甲双酮为探针药建立了抗癫痫药毒性的斑马鱼胚胎模型。结果显示,斑马鱼胚胎暴露于三甲双酮后出现浓度依赖性的畸形和死亡。畸形表型有生长迟缓,脑区、眼和听囊变小,半规管和耳石受损,以及心血管系统异常。这些表型与临床病例和文献报道很相似。毛细胞染色显示听囊ML2神经丘毛细胞数明显减少。原位杂交检测发现脑标志基因zic1和xb51、自噬基因atg5的表达图式发生了异常变化。RT-PCR检测显示听觉基因val和hmx2的表达水平也发生了异常变化。这些结果提示脑组织和控制身体平衡及听力的神经感受器是三甲双酮的主要毒性靶位。斑马鱼胚胎和幼体可以模拟三甲双酮对哺乳动物的致畸和神经毒性反应。

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三甲双酮(Trimethadione)原为临床抗癫痫药,对改善癫痫小发作疗效显著。但后来发现该药物可导致胎儿心脏畸形及头面畸形、发育迟缓和智力低下等症状[1,2],即胎儿三甲双酮综合征(Fetaltrime-thadionesyndrome),因此临床上已不常用。近30年来,已有丙戊酸钠、氨己烯酸、苯妥英钠、普瑞巴林、左乙拉西坦、奥卡西平等10余种用于治疗癫痫症的药物上市,但发生严重药物不良反应的比例仍较高[3],因此研发新的低毒高效抗癫痫药是医药界的迫切任务。癫痫(Epilepsy)是一种慢性中枢神经系统疾病,也是儿童和青少年最常见的严重神经性疾病,病因复杂,发病机制不明,但无性别差异。研究表明在15岁前至少有1.0%~1.7%儿童会无缘由地发作一次,其中8%会反复发作。在1岁以内的发病率最高,达15/10000人每年,9岁后发病率下降至5/10000人每年[4,5]。研究表明,癫痫的高发病率与家族和遗传关系密切[6]。这就意味着一定数量的患儿长辈可能是癫痫患者,而其中一些女童患儿长大后可能成为新的癫痫病孕妇。目前在临床上,癫痫病孕妇面临两难境地:服用抗癫痫药物可能会导致胎儿发育畸形;突然停用或减少抗癫痫药的服用,很容易造成癫痫发作,也会严重影响胎儿发育。解决途径之一是在研发新的抗癫痫药的过程中,加强临床前的安全性评价,对其潜在的致畸性进行充分研究。由此对抗癫痫药致畸性的检测技术和评价方法提出了新的更高要求。近年来斑马鱼用于化合物致畸性的快速高通量筛选,已得到国际上同领域的认可[7,8]。斑马鱼系统具有灵敏、简便、快速、可靠的优点,不仅能够用于新药的早期筛选,而且在临床前安全性评价以及上市药物的再评价中也可被采用,因此具有较高的应用价值。斑马鱼胚胎能够激活致畸原化合物而不需添加外源的代谢激活系统,而且致畸效果是浓度依赖的且与人类暴露数据相关[9],因此斑马鱼是一良好的检测化合物致畸毒性的模式动物。为了更充分地了解抗癫痫药物的致畸毒性,本研究以三甲双酮为阳性化合物,研究其对斑马鱼胚胎发育的不良影响,以期建立抗癫痫药物致畸毒性的斑马鱼检测模型。临床上抗癫痫药物主要是通过减缓或减弱脑区病灶神经元离子通道的活性,抑制病灶神经元异常放电,达到治疗效果。抗癫痫药物常见的不良反应多涉及神经系统如共济失调、眼球或手指震颤、眩晕、嗜睡、精神萎靡;也出现血液毒性如贫血、白细胞和血小板减少,以及肝毒等;致畸毒性有小头症、智障、斜视、眼距过宽和听觉损伤等神经系统发育异常[2,10,11]。因此,在本文斑马鱼建模研究中,主要关注三甲双酮对胚胎早期发育和神经系统发育的影响。1材材材材材1.1材料斑马鱼(Daniorerio)野生型AB品系,由清华大学生命科学学院孟安明教授惠赠。三甲双酮(T0781-1G,3,5,5-Trimethyloxazolidine-2,4-dione)购自Sigma-ALDRICH公司,纯度大于99.5%。1.2方法1.2.1斑马鱼饲养和受精卵的收集方法养殖方法基本按照《ZebrafishBook》(http://www.zfin.org)进行。主要饲养条件和受精卵收集见文献[12]。参照文献[13]配制斑马鱼饲养用水:高级海水晶(购自天津中盐海洋生物科学有限公司)20g加入80升反渗水中,搅匀。斑马鱼胚胎发育期间直至孵化后第一天(4dpf,4dayspostfertilization,受精后第4d)不喂食,自5dpf开始喂食。1.2.2斑马鱼胚胎给药处理及畸形观察用灭菌反渗透水配制三甲双酮母液50mg/mL。测试浓度药液均用斑马鱼饲养用水直接稀

参考文献

引证文献

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