剑麻与烟草疫霉互作过程中的转录组研究

作者:张燕梅;赵艳龙;李俊峰;鹿志伟;杨子平;陆军迎;周文钊; 刊名:热带作物学报 上传者:曹宇波

【摘要】斑马纹病是剑麻的主要病害之一,为了挖掘剑麻斑马纹病抗病相关基因,以斑马纹病抗病品种热麻1号为材料,分别在接种0、24、36、48和72 h进行转录组测序,组装后获得103 326个转录本和70 110个Unigenes,转录本和Unigene的平均长度分别为726 bp和645 bp。其中有33 474个Unigenes被成功注释到NR,NT,KO,Swissport等7个功能数据库中。DEG分析表明,在接种24、36、48、72 h后分别有4 676、3 769、3 308、3 757个Unigenes被诱导差异表达,且PR蛋白,类黄酮生物合成、苯丙素类生物合成、过氧化物酶等基因上调表达明显,而热击蛋白、细胞色素P450和叶绿素a/b结合蛋白等基因明显下调表达。差异基因代谢通路分析表明,参与核糖体、光合作用、苯丙素类生物合成、苯丙氨酸代谢通路、植物激素信号转导途径、类黄酮生物合成途径、脂肪酸生物合成途径等代谢通路明显富集。本研究全面了解剑麻与烟草疫霉互作关系,是为剑麻斑马纹病抗病机制研究提供理论基础。

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剑麻是我国热区特有的经济作物之一。剑麻不仅是主要的热带纤维原料[1],同时剑麻茎心是酿造龙舌兰酒的主要原料[2],剑麻麻渣含有较高皂素,可用来制药[3],剑麻也是一种重要的生物质能源[4],近年来,剑麻作为景天庚代谢的模式植物[5],有非常重要的理论和经济价值。斑马纹病是剑麻的主要病害之一,主要由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae Breda)引起,因斑马纹病导致大面积麻园被毁,纤维产量下降,严重影响了剑麻产业的发展[6-7]。国内外学者对该病进行了大量研究,但仅局限于病原菌分离、鉴定和防治方面,对该病的致病机制和抗病机理仍不清楚[8-9]。目前的主栽品种H.11648抗斑马纹病能力较差,要从根本解决剑麻斑马纹病的抗性问题,主要通过如下途径:第一是培育抗斑马纹病的优异新种质;第二是对现有品种进行遗传改良。由于剑麻自身的生物学特性限制,在短期内获得抗病新品种较难实现,因此要解决剑麻斑马纹病抗性问题,必须在现有研究的基础上研发出一种相对快速高效的方法,而转基因技术能满足上述要求。随着剑麻分子生物学的深入开展,一些功能基因被成功分离,剑麻再生体系和遗传转化体系已经建立,已有关于剑麻转基因研究的成功报导[10-12]。因此,本研究采用转录组的方法,从现有斑马纹病抗病品种热麻1号中挖掘斑马纹病抗病相关基因,为利用转基因技术开展剑麻品种的遗传改良提供基因资源,为探讨剑麻斑马纹病抗病机制提供参考。1材料与方法1.1材料植物材料为2年生的热麻1号盆栽苗,菌株为本实验室前期分离保存的烟草疫霉(Phytophthoranicotianae Breda)。1.2方法1.2.1病原接种将保存于PDA斜面的烟草疫霉转接到V8培养基上,28℃培养1周后接种。病原接种采用菌斑活体接种法,选取同一螺旋健康的叶片,接种前先用无菌水将叶片擦洗干净,再用酒精棉反复擦拭叶片,然后用灭菌大头针刺伤叶片表面,取直径0.5 cm大小的菌饼将带菌丝面贴于伤口处,用棉花保湿,每隔2 h加一次水,每3个生物学重复当作1个处理,每个处理重复2次。1.2.2 RNA提取分别在接种0 h(RC)、24 h(RI24)、36 h(RI36)、48 h(RI48)和72 h(RI72)取热麻1号叶片,经液氮速冻后,用植物RNA提取试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司)提取总RNA,经酶联免疫分析系统(TECAN SPARK 10 mol/L)和琼脂糖凝胶电泳检测后送北京贝瑞和康生物技术有限公司进行测序。1.2.3 c D N A文库构建和转录组测序采用Illumina Hiseq 2500测序平台进行测序,测序前先用带有Oligo(d T)的磁珠富集m RNA,然后将m RNA打断后合成第一链c DNA和第二链c DNA,经纯化、粘性末端修复、加接头以及片段大小选择后进行PCR扩增,最后用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI Step OnePlus Real-Time PCR System检测,检测合格后进行测序。总计5个时间点2次重复共10个样本。1.2.4序列组装与功能注释由于剑麻参考基因组未知,在组装时按照无参考基因组的样本进行分析。所得原始数据先过滤,然后采用Trinity软件[13]进行组装拼接成转录本,所得转录本去冗余后获得Unigene,最后对Unigene进行Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG和GO等基因功能注释。1.2.5差异表达基因的筛选根据基因表达水平,采用DESeq[14]分析软件进行基因差异表达分析,筛选受

参考文献

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