大黄酸增强低氧环境中效应T细胞的抗结肠癌活性

作者:袁向飞;田文聪;谢俊木子;王丰; 刊名:中国中西医结合外科杂志 上传者:时宝琦

【摘要】目的:验证中药有效成分大黄酸抑制低氧引起的结肠癌细胞中免疫抑制分子的表达,为大黄酸与效应T细胞的联合应用提供基础理论依据。方法:首先根据CCK-8检测大黄酸对结肠癌细胞系的细胞毒作用,选择恰当的研究浓度;然后用Western blot和q PCR检测在低氧条件下,一定浓度的大黄酸能否下调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和某些免疫抑制分子的水平;最后在我们自己建立的能够被T淋巴细胞特异识别杀伤的结肠癌细胞模型上,进一步检测大黄酸在低氧条件下对效应T细胞活性的影响。结果:与常氧对照组相比,低氧组、低氧+25μM大黄酸组和低氧+50μM大黄酸组细胞中程序性死亡受体-配体1(PD-L1)m RNA的相对量分别为1.63±0.29、0.80±0.17和0.47±0.12;半乳糖凝集素-1(galectin-1)m RNA的相对量分别为4.42±0.73、0.47±0.11和0.24±0.11。当效靶比为1:1、2:1和4:1时,T细胞对肿瘤细胞的杀伤百分率分别为(27.32±3.05)%、(42.68±3.69)%和(54.02±1.82)%;而低氧条件下,杀伤百分率分别下降至(21.53±3.74)%、(33.55±1.51)%和(45.20±2.27)%;在低氧条件下加入50μM大黄酸,杀伤百分率又分别升高至(32.70±2.37)%、(47.01±3.15)%和(57.26±1.12)%,各组之间有显著性差异(P<0.05)。结论:一定浓度的大黄酸能够降低低氧引起的免疫抑制分子表达升高,并且可以逆转由于低氧产生的效应T细胞活性下降。大黄酸有望与T细胞过继免疫疗法联合使用,用于结肠癌的治疗。

全文阅读

作为一种过继免疫疗法,CD19嵌合抗原受体T细胞CAR-T(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)在治疗B淋巴细胞白血病方面取得了举世瞩目的成功,被认为是CAR-T治疗技术的里程碑;由此,CAR-T在治疗实体肿瘤领域中的应用也成为了新近的肿瘤免疫治疗研究的热点[1]。Katz等[2-4]利用以癌胚抗原为靶点的CAR-T(CEACAR-T)开展了一系列针对结肠癌肝转移和腹膜转移的临床前研究工作,特别是对于肝转移的治疗已经进入临床Ⅰ期试验阶段;然而,他们也同时指出肿瘤固有的免疫抑制微环境是限制CAR-T疗效的重要原因之一。实体肿瘤的免疫抑制微环境与其瘤内的低氧状态密切相关,许多研究业已证实:在低氧环境中,肿瘤细胞往往会上调诸多免疫抑制分子,比如程序性死亡受体-配体1(PD-L1)[5-6]、半乳糖凝集素-1(galectin-1)[7]、环氧合酶-2(COX-2)[8]和血管内皮生长因子(VEGF)[9]等。而低氧诱导因子-1(HIF-1)作为低氧环境的重要响应元件,直接调控着上述免疫抑制分子的转录。大黄酸又名1,8-二羟基-3-羧基蒽醌,是中药大黄的主要有效成分之一。在我们的前期研究工作中发现大黄酸能够下调胰腺癌细胞中HIF-1α(HIF-1的亚基)的水平,从而降低其下游分子的表达水平[10]。据此我们认为:在低氧环境下,大黄酸能够通过降低结肠癌中HIF-1α的水平致使其免疫抑制分子的表达下调,从而有助于效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤。1材料与方法1.1细胞培养人结肠癌细胞系HT29和HCT116,以及人胚肾来源的细胞系293 T用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养。低氧条件培养在低氧罐进行,步骤如下[11-12]:用N2(95%)和CO2(5%)的混合气体充满罐体,待罐内O2水平降为1%时,密封并置于37℃。常氧条件培养在37℃、5%CO2的恒温培养箱中常规进行。将健康成人志愿者的外周血用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离出单个核细胞。分离出的细胞用含10%FBS和100 U/m L重组人白介素-2的RPMI-1640培养基于37℃、5%CO2的恒温培养箱中常规培养,隔天换液一次。1.2细胞生存率实验各细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板,经不同浓度的大黄酸处理48 h后,用CCK-8试剂检测细胞的生存率。实验重复3次,每次设3个平行复孔。1.3实时定量PCR(q PCR)收集不同处理后的细胞,加入Trizol试剂,提取总RNA。将4μg总RNA用Super Script?First-Strand Synthesis System逆转录成c DNA。用SYBR?Premix Ex Taq?kit进行PCR,步骤如下:95℃变性5 s;60℃退火34 s;40个循环。β-actin作为内参基因。各基因引物序列见表1。结果用ΔΔCt法分析,实验重复3次,每次设3个平行复孔。表1 q PCR所用引物序列基因名上游引物下游引物PD-L1 TGTACCGCTGCATGATCAG AGTTCATGTTCAGAGGTGACTGgalectin-1 CGCTAAGAGCTTCGTGCTGAAC CACACCTCTGCAACACTTCCAGβ-actin GGACATCCGCAAAGACCTGTA GCATCCTGTCGGCAATGC1.4外周血淋巴细胞(PBL)特异识别细胞系的建立m CD3scfv的序列由中国医学科学院血液学研究所熊冬生教授馈赠,该序列包括信号肽、HA标签、柔性肽链、CD3抗体轻链可变区、C

参考文献

引证文献

问答

我要提问