g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达

作者:夏海雄;李莉;周艳华;任平平;何志旭;舒莉萍; 刊名:浙江大学学报(医学版) 上传者:向治霖

【摘要】目的:观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法:利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pCS~(2+)重组质粒,并将其显微注射入斑马鱼胚胎内,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;蛋白质印迹法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白的表达量;改良G6pd定量比值法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd酶活性。结果:g6pd基因在进化过程中相对保守,斑马鱼与人类的G6pd蛋白质相似度为88%,斑马鱼与小鼠的G6pd蛋白质相似度为87%。原位杂交试验结果显示,g6pd基因主要表达于斑马鱼的造血组织,显微注射g6pd-EGFP-p CS2+重组质粒后观察的结果与原位杂交试验结果一致。24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白相对表达量分别为1.44±0.03、1.47±0.05、1.54±0.02,差异无统计学意义(P>0.05);G6pd酶活性分别为1.74±0.17、1.75±0.12、1.71±0.22,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功观察到斑马鱼体内g6pd基因表达部位及其变化规律,并测定了不同发育时相斑马鱼胚胎中G6pd蛋白表达和酶活性,为建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。

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葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency,G6PD缺乏症)全球罹患人数约4亿,是最常见的遗传性红细胞酶缺陷病,也是引起溶血性疾病的重要原因之一[1-2]。机体G6pd酶活性缺乏会影响烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate,NADPH)的产生,从而减弱机体还原型谷胱甘肽及其他抗氧化剂的抗氧化效果,使红细胞中的血红蛋白和红细胞膜在接触氧化性物质时易发生损伤[3-4]。建立G6PD缺乏症的动物模型对研究其发病机制和药物筛选有重要意义。已有研究表明,用线虫、小鼠建立的G6PD缺乏症动物模型有很大的局限性[5-6],如小鼠是体内受精,宫内发育,不便于观察G6PD缺乏对小鼠胚胎早期发育的影响。在过去的20年中,斑马鱼已广泛应用于人类疾病、脊椎动物的发育 和血液系统相关疾病的研究[7-8]。利用斑马鱼建立动物模型具有以下优势:(1)斑马鱼胚胎在体外发育过程呈全透明状态,可直接动态监测其造血系统发育全过程;(2)斑马鱼胚胎发育周期短,便于快速进行细胞生物学研究;(3)斑马鱼造血调控网络与人类高度相似,决定了其可成为g6pd基因缺陷这类遗传性疾病的理想模型[8-9]。本研究采用原位杂交技术和蛋白质印迹法分别检测g6pd基因和G6pd蛋白的表达,通过绿色荧光蛋白追踪活体野生型斑马鱼g6pd基因的表达,并利用改良G6pd定量比值法检测野生型斑马鱼胚胎发育不同时相的G6pd酶活性,以期为下一步构建G6PD缺乏症斑马鱼模型的表型分析和判断奠定基础。1材料与方法1.1动物、材料和仪器野生型斑马鱼Tuebingen胚胎由本课题组繁育,置于28.5℃的生化培养箱中孵化,每天更换斑马鱼胚胎营养液两次,5~7 d开始喂食草履虫,10~14 d开始喂食丰年幼虫。待野生型斑马鱼发育至性成熟,按雌雄2∶1或1∶1进行配对,成鱼置于28.5℃左右自动循环系统饲养,每日喂食两次丰年幼虫。光照环境12 h,黑暗环境12 h,交替进行[10]。增强绿色荧光蛋白EGFP-p CS2+载体由本课题组保存。总RNA提取试剂、地高辛标记的RNA混合物为美国Ambion公司产品;BCIP/NBT碱性磷酸酶底物显色试剂盒Ⅳ为日本Vector公司产品;改良G6pd测定试剂盒为广州米基科技发展有限公司产品;兔G6pd多克隆抗体、兔Actin多克隆抗体为美国Abcam公司产品;HRP标记的羊抗兔二抗为北京索莱宝科技有限公司产品;限制性核酸内切酶Bam HⅠ、EcoRⅠ为美国ThermoFisher Scientific公司产品。电泳、转膜设备及相关耗材为美国Bio-Rad公司产品;杂交炉为美国Spring Scientific公司产品;低温离心机为德国Eppendorf公司产品;荧光显微镜(SMZ1500)为日本Nikon公司产品;化学发光成像仪为上海勤翔科学仪器有限公司产品。1.2利用数据库和软件分析斑马鱼g6pd基因的生物学信息1.2.1利用基因数据库进行g6pd基因的共线性分析在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库找出g6pd基因在人类、斑马鱼、小鼠所处的染色体位置,再利用NCBI网站中的Map Viewer功能找出这些基因的具体位置,汇总、对比g6pd基因在人类、小鼠、斑马鱼上的表达,最后在UCSC和Ensemble数据库上比对基因信息,进行共线性分析,了解人类、斑马鱼和小鼠之间g6pd基因的进化关系,最后绘图。1.2.2 BLAST软件对比分析G6p

参考文献

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