梵净山石斛无菌播种及快繁技术

作者:余水生;付双彬;郑英茂;李成惠;程筵寿;杨燕萍; 刊名:浙江农业科学 上传者:黎茶根

【摘要】以梵净山石斛成熟的蒴果为外植体,研究不同培养基、激素浓度处理对梵净山石斛种子萌发、原球茎增殖、不定芽分化与生根的影响。结果表明,梵净山石斛无菌播种最佳的培养基为KN+6-BA 0.5 mg·L~(-1)+NAA0.5 mg·L~(-1)+10%CM+AC 1.0 g·L~(-1),萌发率达到95.5%;原球茎增殖最优培养基为B5+6-BA 1.0 mg·L~(-1)+NAA0.1 mg·L~(-1)+AC 0.5 g·L~(-1);筛选出不定芽分化最适培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg·L~(-1)+NAA 0.2 mg·L~(-1)+10%土豆泥+AC 2.0 g·L~(-1),不定芽增殖最适培养基为1/2MS+6-BA 2.0 mg·L~(-1)+NAA 0.2 mg·L~(-1)+10%土豆泥+AC2.0 g·L~(-1);小苗生根适宜的培养基为1/2MS+NAA 0.5 mg·L~(-1)+10%土豆泥+AC 2.0 g·L~(-1)。

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梵净山石斛(Dendrobium fanjingshanense)为兰科石斛属多年生草本植物,是2001年在贵州省梵净山黑湾河海拔800~1 500 m处发现的一个新种[1]。自发现之时起,一直被认为是贵州特有药用植物之一[2]。直到2010年,叶喜阳等[3]在浙江九龙山国家级自然保护区内也发现了梵净山石斛的分布。九龙山国家级自然保护区是目前浙江省唯一一处记载梵净山石斛分布的区域。梵净山石斛是一种珍稀名贵的中草药,性味甘淡微咸,寒,归胃、肾,主要用于治疗口干、烦渴、热病伤津、肺热干咳、腰膝软弱、阴伤目暗等病症[4]。另外,其花黄褐色或橙黄色,也可作观赏植物,具有较高的观赏价值。因而导致了大规模的采挖和频繁发生非法出口,目前正面临着濒危的状态,然而靠传统的分株繁殖方式,很难起到保育作用。由于梵净山石斛种子微小,胚胎发育不完全,在自然条件下种子通常要与真菌共生才能萌发,造成其种子发芽极为困难。因此采用无菌播种技术为梵净山石斛快速繁殖及开发利用提供技术服务。1材料与方法1.1材料以梵净山石斛开花2 d后进行自交授粉120 d的蒴果为试验材料。1.2方法1.2.1外植体消毒灭菌将梵净山石斛的蒴果用流水冲洗2 h后,在超净工作台上用质量分数75%的酒精浸泡30 s,再然后用无菌水冲洗3次,再用质量分数0.1%Hg Cl2消毒10~12 min,最后用无菌水冲洗5次。1.2.2种子萌发培养基的选择将处理好的蒴果放在无菌操作台上的培养皿中,先切除两端(0.5 cm),然后把蒴果切开,均匀地洒在MS、1/2MS、B5、KN和花宝1号培养基中,附加6-BA和NAA各0.5 mg·L-1,以及10%椰汁(CM),活性炭(AC)含量为1.0 g·L-1,蔗糖质量浓度为30 g·L-1,琼脂为6.8 g·L-1。随时观察萌发情况,60 d后统计萌发率和生长情况。1.2.3原球茎增殖培养基筛选将萌发培养基上的原球茎转入到增殖培养基上,采用L16(45)的正交试验设计设置不同基本培养基(1/2MS、KC、B5、VW)、6-BA浓度(1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1)、NAA浓度(0、0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、AC含量(0、0.5、1.0、2.0 g·L-1)等4个因素对梵净山石斛增殖的影响,40 d后统计增重并计算增殖倍数。1.2.4原球茎分化与丛生芽增殖将增殖的原球茎转接入基本培养基1/2MS中,添加6-BA浓度(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)和生长素NAA浓度(0.1、0.2、0.5 mg·L-1)组合的芽诱导培养基,培养基中AC含量为2 g·L-1、蔗糖质量浓度30 g·L-1、琼脂6.8 g·L-1,每个组合培养基为10瓶,每瓶10个原球茎,30 d后统计分化芽数及生长情况,60 d后统计丛生芽数并计算增殖系数。1.2.5生根诱导待丛生芽长至2 cm高时转接入1/2MS培养基,分别添加不同浓度的NAA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)和IBA(0.2、0.5、1.0 mg·L-1)到生根诱导培养基中,AC含量为2 g·L-1,蔗糖质量浓度为30 g·L-1,琼脂7.7 g·L-1。每个组合培养基为10瓶,每瓶2~3个分化小芽,每隔3~4 d观察培养基中的情况,30 d后统计生根率、观察根系生长状况。1.2.6培养条件培养室环境的温度为(22±2)℃,光照强度为2 000 lx,日光照时间为12 h。2结果与分析2.1种子萌发将梵净山石斛的种子接到为MS、1/2MS、KN、B5、花宝1号及附加BA、NAA浓度为0.5 mg·L-

参考文献

引证文献

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