靶向大鼠C5aR基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定(无全文)

作者:张泽英;高小龙;刘东旭; 刊名:现代免疫学 上传者:

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【摘要】构建靶向大鼠C5aR基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,验证C5aR蛋白的功能,为后续进一步研究C5aR在免疫治疗中的作用奠定基础。具体方法是根据基因库提供的大鼠C5aR mRNA核苷酸序列(序列号:NM_053619),设计并合成短发夹结构的互补DNA序列,克隆到经BamHI和EcoR I双酶切的线性化质粒pLVX-shRNA,构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定。重组干扰质粒构建成功后,通过脂质体2000转染大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,LPS处理后收集细胞,采用荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测干扰质粒对C5aR基因的表达抑制效应。通过尾静脉高压注射技术将重组干扰质粒导入Wistar大鼠肾脏,采用腹腔注射LPS方法复制脓毒血症急性肾损伤模型,大鼠随机分为正常对照组、LPS处理组、LPS+C5aR shRNA转染组,采用ELISA方法检测血清中Cr、BUN以及TNF-α、IL-6等炎性因子的含量。结果显示构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致,重组质粒构建成功。转染C5aR shRNA后,NRK-52E细胞中C5aR mRNA和C5aR蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。该重组干扰质粒能有效抑制C5aR基因的表达,能显著抑制由LPS诱导的TNF-α、IL-6等炎性因子的释放,改善大鼠肾脏功能,对LPS诱导的肾脓毒血症损伤具有明显保护作用。

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收稿日期:2017-10-09 基金项目:国家自然科学基金(31070776 );武昌工学院博士科研启动基金(2017BSJ03);湖北省自然科学基金(2018CFB696) 作者简介:张泽英(1980-),女,四川泸州人,博士,副教授,研究方向:食品科学与安全通信作者:刘东旭( E-mail:dxl@hubei.edu.cn) 靶向大鼠 C5aR 基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定 张泽英1,2,高小龙2,刘东旭2 ( 1.武昌工学院 食品与环境工程学院,武汉 430065;2.湖北大学 生命科学学院,武汉 430062) 摘要:构建靶向大鼠 C5aR 基因的短发夹 RNA(shRNA)表达载体,验证 C5aR蛋白的功能,为后续进一步研究 C5aR在免 疫治疗中的作用奠定基础。具体方法是根据基因库提供的大鼠 C5aR  mRNA核苷酸序列(序列号:NM_053619),设计并合 成短发夹结构的互补DNA序列,克隆到经BamHI和 EcoR I双酶切的线性化质粒pLVX-shRNA,构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定。重组干扰质粒构建成功后,通过脂质体2000转染大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,LPS处理后收集细胞, 采用荧光定量 RT-PCR(RT-qPCR)和 Western blotting法检测干扰质粒对 C5aR 基因的表达抑制效应。通过尾静脉高压注射 技术将重组干扰质粒导入 Wistar大鼠肾脏,采用腹腔注射 LPS方法复制脓毒血症急性肾损伤模型,大鼠随机分为正常对照组、LPS处理组、LPS+C5aR shRNA转染组,采用 ELISA方法检测血清中Cr、BUN以及 TNF-α、 IL-6等炎性因子的含量。 结果显示构建的shRNA序列经 DNA 测序证实与设计序列完全一致,重组质粒构建成功。转染 C5aR shRNA 后,NRK- 52E细胞中 C5aR  mRNA和C5aR蛋白表达水平显著下降( P < 0.05)。该重组干扰质粒能有效抑制 C5aR 基因的表达,能 显著抑制由LPS诱导的 TNF-α、 IL-6等炎性因子的释放,改善大鼠肾脏功能,对LPS诱导的肾脓毒血症损伤具有明显保护 作用。 关键词:C5a受体;RNA干扰;短发夹 RNA 中图分类号:R392.11     文献标志码:A     文章编号:1001-2478(2018)03-0197-06   过敏毒素 C5a是补体系统的活化产物,是一个重要的炎症介质[ 1]。补体系统过度激活导致 C5a大量产生,并诱导其受体(C5aR)在细胞上表达异常[ 2]。C5aR 又称 CD88(cluster of differentiation88, CD88),是目前研究较为清楚的一种与补体C5a相结合的 G 蛋白偶联受体,表达于多种细胞膜上。C5aR通过诱导免疫细胞脱颗粒、细胞因子释放和氧化爆发等激发和放大炎症反应[ 3],对急性炎症反应的发生发展起着重要作用。C5a主要通过与C5aR相互作用,介导脓毒症、缺血再灌注、老年性黄斑病、神经退行性疾病等[ 4],最终导致器官功能损伤,因此,干扰、阻断 C5a /C5aR 信号过程在炎性疾病的治疗中具有潜在意义。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来发现的一种高效、特异性阻断 mRNA表达而导致转录后基因沉默的现象,从而干扰相应的特异性蛋白的表达,最终影响细胞的生物学功能。它是一种 天然存在的转录后基因调控的内源性机制,目前通常用于基因功能表征和疾病潜在治疗策略的开 发[ 5]。本文以大鼠 C5

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