库尔勒香梨kfpSPL及其启动子克隆分析

作者:王玉凯;赵欢;牛建新; 刊名:新疆农业科学 上传者:李辉

【摘要】【目的】研究库尔勒香梨萼片脱落、宿存与kfpSPL基因之间存在的关系,并克隆该基因及其启动子。【方法】以库尔勒香梨花器官作为材料,库尔勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列以及梨基因组信息为模板设计引物,通过PCR获得该基因及其启动子,进行上游调控序列顺式作用元件的预测分析(PLACE数据库和Plant Care数据库)。【结果】克隆获得kfpSPL基因的基因组DNA序列长度为3 320 bp和2 332 bp的上游启动子调控序列,kfpSPL基因的基因组DNA与Pyrus bretschneideri数据库中的一段长度相同的序列具有99%的同源性,E值为0,并发现该基因有三段内含子,将克隆得到的启动子序列在梨全基因组序列数据库中进行相似性搜索,发现克隆得到的上游启动子序列的1~796 nt和1 042~2 332 nt分别与scaffold291.0中290 783~289 988 nt和289 990~288 701 nt的同源性为96%和97%,E值均为0。以生物信息学分析为依据,kfpSPL启动子序列中存在一些相关的调控元件,赤霉素响应元件GARE-motif、P-box,光响应中的顺式作用元件ACE、Box Ⅱ、CATT-motif、G-box、TCT-motif、Box 4,防御和应激反应中的顺式作用元件TC-rich repeats,启动子和增强子区的共同顺式作用元件CAAT-box等,转录起始的核心启动子元件TATA-box等。【结论】kfpSPL基因启动子序列中存在与赤霉素、脱落酸、水杨酸等激素相关的顺式作用元件,不同生长调节剂处理脱萼果和宿萼果的花器官可以调控kfpSPL基因的表达水平。

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0引言【研究意义】库尔勒香梨是蔷薇科植物、梨属中的新疆梨种(Pyrus sinkiangensis yu)。受遗传特性的影响,库尔勒香梨的果实萼片存在两种情况,即脱落与宿存,萼片的宿存形成宿萼果,大量的宿萼果导致果实果形不规则,严重影响果实的口感、外观与品质,致使库尔勒香梨降低其商品价值和市场竞争力。从分子水平研究库尔勒香梨kfp SPL基因与萼片脱落和宿存之间的关系,对提高库尔勒香梨果实的品质及外观有重要意义。【前人研究进展】近年来,关于库尔勒香梨萼片的发育规律及其萼片脱落过程中相关内激素的变化规律已有相关报道[1,2]。前人研究表明,库尔勒香梨的脱萼和宿萼差异表达的众多片段中有两条与苹果中的转录因子有较高的同源性[3,4]。此外,孙晓霞等[5]运用RNA-Seq技术获得库尔勒香梨脱萼组和宿萼组代表样品的转录本数据,筛选出脱萼组和宿萼组样品的差异表达基因并且获得了相应基因的功能注释。在王博慧等[6]的研究中发现,通过克隆技术得到了kfp MYB及其启动子,并对已获得的上游序列进行了生物信息学分析。在植物开花调控过程中SPL转录因子具有重要意义,控制植物开花的光周期诱导途径和赤霉素诱导途径[7]。【本研究切入点】以往对于库尔勒香梨脱萼和宿萼的研究主要集中在生理研究层面,如植物生长调节剂[8]、形态[1]、修剪[9]、光照[10]、授粉[11]等生理因素对库尔勒香梨萼片脱落与宿存 的研究。作为调控基因的重要组成部分,启动子控制基因的表达时间和程度,它是一段特定的DNA序列,可与RNA聚合酶识别、结合及起始转录。研究库尔勒香梨萼片脱落与宿存的分子机理。【拟解决的关键问题】克隆kfp SPL基因的全长基因组DNA序列及其启动子,了解该基因如何应答激素和环境条件。1材料与方法1.1材料4月中旬在新疆库尔勒市沙依东园艺场五分场,标记3株树龄为10a的库尔勒香梨树作为试验树,于盛花期(全树50%花朵开放),采集标记库尔勒香梨树的全花(花梗以上部分),三棵试验树各30朵花,去除花瓣并将剩余部分从萼片和子房交界处分割成两部分,分别用锡箔纸包好,迅速投入液氮中保存,带回实验室置于-80℃超低温冰箱中备用。1.2方法1.2.1库尔勒香梨kfp SPL的基因组DNA克隆以天根公司新型植物基因组小型提取试剂盒说明书为依据进行库尔勒香梨基因组DNA的提取。使用试验已获得的库尔勒香梨kfp SPL基因的c DNA序列及梨基因组信息为模板设计引物。上游引物为SPL1-S为5‘-TTGCTGCCTCCTAC-CCTG-3’,下游引物为SPL1-A为5‘-ACTT-GCCAAACTAAACATC-3’。以库尔勒香梨基因组DNA序列为模板进行kfp SPL基因组DNA序列的扩增。其PCR反应体系为:10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+Plus)2.5μL,d NTP Mixture(2.5mmol/L)4μL,模板1μL,上下游引物(20μmol/L)1μL,LA Taq酶(5 U/μL)0.25μL,灭菌蒸馏水加至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s;51℃退火30s;72℃延伸2min;30个循环;72℃延伸10 min。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的结果,使用胶回收试剂盒回收PCR产物。回收的PCR扩增产物与p EASY-T1载体连接,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中、使用麦康凯培养基进行筛选,通过菌液PCR筛选阳性克隆产物,将菌液PCR扩增的阳性克隆产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果使用DNAMAN

参考文献

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