CNTF对视神经损伤后视网膜神经节细胞凋亡的影响

作者:李煜德;段香星;钱志敏 刊名:内蒙古医学杂志 上传者:张存玉

【摘要】目的:研究睫状神经营养因子(CNTF)对视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的影响。方法:采用中号显微血管夹建立视神经中度损伤模型后,取左眼作为治疗组,在即时、1、37、d时分别向玻璃体腔内注入2μl(1μg/μl)CNTF溶液;取右眼作为实验对照组,同治疗组在每个时间点向玻璃体腔内注入2μl双蒸水。于伤后1、3、71、4 d时分别做HE染色、原位末端标记法(TUNEL)检测。结果:光镜下观察治疗组细胞形态明显好于实验对照组。TUNEL显示凋亡RGCs数随视神经损伤时间延长而变化(P<0.05)。伤后1 d,治疗组和实验对照组凋亡RGCs数两组间相比较无统计学意义(P>0.05)。伤后3、7、14 d时治疗组的凋亡RGCs数明显比实验对照组少(P<0.05)。结论:玻璃体腔内注射外源性CNTF可以减少RGCs的凋亡,对视神经中度损伤后RGCs具有明显保护作用。

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视神经损伤多见于颅脑创伤[1],常导致病人视力的严重损害,视神经损伤引起视功能损害的病理基础是视网膜神经节细胞的进行性死亡和视神经纤维的丢失[2],从而导致视力障碍及视野缺损。Cui等[3]研究表明,在众多神经营养因子中,CNTF是唯一有效促进RGCs再生的神经营养因子。CNTF对多种神经元的存活以及RGCs均有支持作用,能够促进多种神经细胞的存活[4]。因此本实验选用CNTF作为促进因子,观察其对视神经损伤后RGCs凋亡的影响,为临床治疗提供必要的理论基础和治疗途径。1材料与方法1.1实验动物及分组内蒙古医学院动物实验中心提供健康无眼疾青紫兰兔26只,体重2.0~2.5kg,雌雄不限,外眼及眼底检查正常,随机选取24只兔,建立视神经中度损伤模型后,取左眼作为治疗组,在即时、1、3、7d时分别向玻璃体腔内注入2l(1g/l)CNTF溶液;取右眼作为实验对照组,同治疗组在每个时间点向玻璃体腔内注入2l双蒸水。于损伤后1、3、7、14d各时间点随机抽取6只兔做HE染色、TUNEL检测。剩余2只兔设为正常对照组,不作任何处理,直至观察期结束采用HE染色、TUNEL检测。1.2动物模型的建立术前用速眠新(0.1~0.2ml/kg)注射液由耳缘静脉推注麻醉动物后,将兔固定于实验台上。于显微镜下剪开颞上方球结膜,分离球结膜下组织,在上直肌及上斜肌肌止端处作牵引缝线,将眼球向眶前外下方向牵拉,以暴露视神经,向深部分离视神经约5mm,用中号显微血管夹于球后3mm处钳夹视神经20s,庆大霉素生理盐水冲洗眶腔,缝合球结膜,结膜下注射庆大霉素1万单位,术后涂抗生素眼膏,观察伤眼瞳孔散大,直接对光反应消失,眼底检查视网膜血管无出血及梗塞,无眼球突出及眼睑闭合不全者纳入实验。1.3给药方式动物麻醉后,用消毒后的10l微量进样器吸取药物,于兔眼球上方赤道部(距角巩膜缘3mm)斜向后下方进针,于瞳孔直视下观察针尖避免损伤晶体。治疗组于伤后即时、1、3、7d玻璃体腔内注射CNTF2l(1g/l),实验对照组于同时间点玻璃体腔内注射等量双蒸水。1.4标本的取材分别在治疗组和实验对照组建立视神经中度损伤模型后1、3、71、4d和正常对照组14d时散瞳直接检查后,符合要求的于心脏灌注致死,摘除眼球。1.5光镜标本制备标本放入4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定24h后,梯度浓度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(片厚4m,连续切片5~10张)、苏木素-伊红(HE)染色后在显微镜下观察、摄片。1.6TUNEL检测凋亡细胞用末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynu-cleotidyltransferase,TDT)促使带标记生物素的dUTP和DNA断端的缺口末端结合,抗生物素蛋白放大结合信号,并以DAB显色,于光镜下辨认标记的细胞核。1.7统计学处理TUNEL检测后,凋亡RGCs计数,将数据输入计算机,拟采用SPSS14.0进行统计分析。治疗组与实验对照组在相同时间点的差异性比较用配对t检验,各组内部不同时间点的凋亡分布变化采用方差分析,同时绘制图表分析数据。2结果2.1HE染色结果光镜下正常视网膜十层结构清楚。正常对照组视网膜节细胞层(GCL),RGCs形状大小不一,轮廓不规则,一个大而深染的细胞核。多位于细胞一侧,细胞边界清晰,呈条带状。伤后1d,实验对照组的GCL层部分RGCs肿胀,神经纤维水肿。治疗组相应的组织结构变化轻。伤后3d,实验对照组的GCL层大部分RGCs核染色质浓缩、边聚,RGCs数量相对减少,神经纤维水肿(图1)。治疗组除相应的组织结构变化较轻外,凋亡细胞数量明

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