改良巢式逆转录聚合酶链反应检测大肠癌血中微转移

作者:胡庆宏;易诚予;彭燕;刘明圭;熊建萍 刊名:江西医学院学报 上传者:代安荣

【摘要】目的探讨改良巢式RT-PCR法检测大肠癌患者外周血中CK20mRNA的表达情况,并分析其与微转移的关系,建立一种简便、快速的检测血中癌细胞微转移的方法。方法采用改良的巢式RT-PCR技术检测大肠癌患者及正常对照组外周血CK20mRNA的表达。结果CK20mRNA在正常对照组中均无表达,在大肠癌患者中阳性表达率为55.4%(62/112)。不同细胞分化程度大肠癌患者其外周血中CK20mRNA阳性表达率无显著性差异(P>0.05);而不同Dukes分期大肠癌患者其外周血中CK20mRNA阳性表达率有显著性差异(P<0.05)。结论改良的巢式RT-PCR技术检测血中微转移大肠癌细胞的CK20mRNA具有简便、快速、灵敏的优点,有助于癌细胞微转移的早期诊断,有助于指导辅助化疗和监测疗效。

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细胞角蛋白20(Cytokeratin20,CK20)是一种大肠组织特异性蛋白,几乎在所有大肠癌组织中表达,而正常血管内皮细胞及造血细胞不表达,因此,CK20的表达可以作为大肠癌肿瘤患者血中癌细胞存在的特异性标志,用以评价大肠癌术后各种治疗方案的疗效及预测复发和检测血中微转移的出现。由于血中微转移的大肠癌细胞数量极少,用常规的诊断技术尚不能检出CK20,现在主要用逆转录聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)技术来检测大肠癌细胞的CK20mRNA,具有特异性强、灵敏度高等优点[1-2]。但这种常规的RT-PCR技术敏感性还不是很高,只可以从1mL全血中检出所含的10个大肠癌细胞的CK20mRNA,极大地限制了它在检测血中大肠癌细胞微转移方面的临床应用;因此,在此基础上又发展了巢式RT-PCR技术,可以从1mL全血中检出所含的1个大肠癌细胞CK20mRNA,进一步提高了检测靶基因的敏感度,很适合临床微转移的检测[3]。但此技术操作步骤繁琐,特别是在进行逆转录时,不但费时且所提的总RNA易降解、逆转录效率低、易致假阴性或因样本间交叉污染而易致假阳性。为此,本文采用改良的巢式RT-PCR技术[4]来检测大肠癌细胞的CK20mRNA的表达情况,分析其与微转移的关系,以建立一种简便、快速的检测血中癌细胞微小转移的方法。1资料与方法1.1临床资料2004年3月至2006年7月本院普外科收治各类大肠癌患者112例,其中男62例,女50例,年龄32~81岁,平均56.8岁,均经病理组织学检查确诊。Dukes分期为A期19例,B期31例,C期46例,D期16例。癌细胞分化程度为高分化22例,中分化54例,低分化28例,未分化8例。选择本院职工体检后完全健康者30例为正常对照组,其中男19例,女11例,年龄28~65岁,平均50.5岁。1.2方法1)外周血有核细胞分离:分别抽取正常对照组与大肠癌患者组(术前1d)外周静脉血4mL,EDTA抗凝。用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,并将其收集于离心管中,12000r/min离心5min,弃上清,向细胞沉淀中加入细胞变性液600L,用移液器反复吸打直至细胞完全裂解,置于-35C冰箱中保存备用。2)总RNA提取及鉴定:向600L细胞变性液中加入60L的2mol/L醋酸钠(pH4.0)、600L的水平衡酚、120L的异戊醇与氯仿混合液(149),混匀后于-35放置15~20min后,12000r/min离心15min。小心吸取上清液(切勿吸到中间沉淀层),加入600L异丙醇于-35保存45min以上,然后12000r/min离心15min。弃上清液,沉淀加入预冷的1mL75%乙醇(无水乙醇750L+DEPC水250L)洗涤后,12000r/min离心5min。弃上清液,沉淀真空干燥,加入DEPC水15~30L溶解。用1.5%琼脂糖凝胶电泳(电压120V,30min)观察所提总RNA的完整性。28S、18S、5S条带清晰可见表明所提的细胞总RNA完整性较好,未有分解。用核酸蛋白分析仪检测所提总RNA的纯度及浓度,其A260/280比值均在1.7~1.9之间,表明所提细胞总RNA纯度较好,可用于下一步的逆转录及PCR扩增。3)逆转录及巢式RT-PCR第1轮扩增:取3L总RNA,用TaKaRa产的onestepRT-PCR试剂盒及外引物将总RNA的逆转录及第1轮RT-PCR扩增在同一管中进行,反应总体积为50L,反应条件为5030min,然后942min,再

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