Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究

作者:杨小燕;何志旭;舒莉萍;金皎;黄璟;吴莎莎;马健娟 刊名:《重庆医学》 上传者:邢善芳

【摘要】目的选择斑马鱼作为实验动物模型,研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段,将Rap1基因片段和pCS2+质粒进行体外连接重组,重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后,经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针,采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0.75hpf的细胞分裂连接处、3.70hpf和6.00hpf的动物极、12.00~72.00hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。

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Rap1又称Ras相关GTP结合蛋白,是Kitayama在筛选NIH/3细胞中抑制Ras蛋白转化功能的蛋白分子过程中发现的。Rap1的两个亚型:Rap1a和Rap1b在氨基酸序列上具有超过90%的同源性,且与Ras蛋白有高度同源性。Rap1和其他G蛋白一样,表现为无活性的GDP结合形式和有活性的GTP结合形式两种构象[1-2]。最初的研究认为Rap1主要是通过直接与Ras的下游效应子相互作用来干扰Ras信号通路,但最近更多的研究结果表明Rap1是一个功能独立的信号通路,通过控制不同的信号通路参与调节细胞的粘连、细胞间连接形成、细胞极性和细胞的增殖与分化[3-4]。目前,随着研究的进展,对Rap1基因的生物学功能有了较为深入的认识,但Rap1基因在活体内的表达情况报道较少,本研究选择斑马鱼作为模式生物,通过克隆Rap1基因,采用全胚胎原位杂交技术(wholemountinsituhybridization,WISH)探求Rap1基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况,进而为Rap1基因在野生型斑马鱼胚胎发育早期功能的研究建立一定的基础。1材料与方法1.1实验动物本实验所选的野生型斑马鱼Tuebingen和pCS2+质粒由上海生命科学院馈赠。斑马鱼养殖根据Westerfield[5]描述的方法进行,水温28.5,交替给予照明14h,黑暗10h,定时喂以饵料。直至雌、雄斑马鱼生殖功能发育成熟后,将雌、雄斑马鱼按11或12进行交配,次日清晨收集斑马鱼受精卵,斑马鱼胚胎的发育阶段按文献[5]描述的形态特征区分。为了方便观察原位杂交结果,受精后超过24h的胚胎给予0.003%苯硫脲(PTU)处理防止黑色素形成,收集后的胚胎经固定、脱水后保存于-20备用。1.2试剂聚合酶链反应(PCR)引物(北京诺赛生物有限公司),质粒小抽试剂盒(Axygen公司),限制性内切酶ClaI和XbaI(Tiangen公司),T3酶(Ambion公司),BCIP/NBTAlka-linephosphatasesubstratekit(VectorLaboratories公司),T4连接酶(FBI公司),Trizol(Invitrogen公司),DIGRNALa-belingmix和Anti-digoxigeninAP-conjungate(Roche公司),生物学显微镜(NikonSMZ645),杂交炉(美国UVP公司HL-2000),紫光分光光度仪(岛津UV1700),LRH系列生化培养箱(上海一恒科技有限公司)。1.3克隆斑马鱼Rap1基因根据斑马鱼cDNA文库中Rap1基因组序列,用Premier5.0软件设计引物,正向引物序列:CCATCGATATGCGTGAATACAAGTTAG;反向序列引物:GCTCTAGATTTCACCCGCAGAATTTG,同时引入ClaI、XbaI酶切位点及保护碱基。以收集0.75~72.00hpf多个时相的Tuebingen野生型斑马鱼胚胎提取的总RNA逆转录得到的cDNA为模板进行RT-PCR扩增,条件为:4030min,30个循环(948min,9430s;5530s,721min),最后7210min,PCR产物大小为321bp,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.4pCS2+-Rap1重组质粒的构建pCS2+质粒利用钙转法转入EcoliDH5感受态菌中,通过氨苄抗性筛选出阳性克隆,扩增后运用碱裂解法提取pCS2+质粒DNA,用ClaI和XbaI双酶切pCS2+质粒,1%琼脂糖电泳后割胶回收。将Rap1基因的PCR产物用ClaI和XbaI

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