Jurkat细胞凋亡的实时电旋转芯片检测

作者:龙泉;邢婉丽 刊名:生物物理学报 上传者:李真

【摘要】细胞凋亡是当今生物学中最受关注的领域之一。当前细胞凋亡的检测方法一般都需要对细胞进行化学处理,不能实现对凋亡的实时监测。为了研究细胞凋亡过程中细胞膜电容的变化规律,采用电旋转芯片测量凋亡细胞的电旋转频谱,进而推算出细胞的膜电容。结果显示,随着时间的增加,凋亡细胞的膜电容逐渐减小。在此基础上提出一种用电旋转芯片测定细胞膜电容的方法来检测细胞凋亡。该方法无需对细胞进行化学处理,可以实现对细胞凋亡的实时监测,为研究细胞凋亡提供了一种新的工具。

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1引言细胞凋亡是细胞自动结束生命的过程,这个过程是由基因决定的。细胞凋亡研究是当今生物学中最受关注的领域之一,肿瘤、艾滋病、变性疾病等各个领域的研究人员都对细胞凋亡研究表现出极大的兴趣。而且,由于它是一个受到高度调控的现象,所以也吸引了生化学家和分子生物学家来研究控制细胞凋亡的胞内机制[1]。检测细胞凋亡的方法有多种,有形态学特征检查,如透射显微镜、扫描电子显微镜观察、流式细胞仪技术;生化特征检测,如碘化丙啶(propidiumiodide,PI)检测、膜联蛋白(annexin)V标记、DNA琼脂糖凝胶电泳法、DNA裂解的原位检测、凋亡蛋白质酶(Caspase)-3及其底物的检测。但上述方法一般都需要对细胞进行化学处理,不能对细胞凋亡进行实时监测。电旋转(electrorotation,ROT)是一项发展迅速的技术,它利用交变电压信号在电旋转芯片上形成旋转电场,细胞便能在旋转电场的作用下发生旋转。细胞因其介电性质的不同,所产生的旋转响应也不同。因此,利用这一特点便能灵敏地鉴定和监测细胞[2~5]。Wang等[6]利用介电电泳(dielec-trophoresis,DEP)技术研究凋亡早期(即细胞膜的磷脂酰丝氨酸外露前后)HL-60细胞的介电特性,得知凋亡细胞的DEP交叉频率(fcrossover)与细胞半径(r)的乘积(rfcrossover)随时间的变化而变化,并且细胞膜电容(membranecapacitance,Cm)减小。但是,在凋亡的中期和后期,细胞的介电特性还是未知的。为了研究整个凋亡过程中细胞介电特性的变化规律,本实验采用电旋转(ROT)技术研究Jurkat细胞凋亡过程中电旋转频谱的变化,推算出细胞膜电容(Cm)并得出其变化规律,进而证实用测定细胞膜电容的方法来检测细胞凋亡是可行的。该方法可以实现对细胞凋亡的实时监测。2材料与方法2.1药品和试剂阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、葡萄糖(glucose)购自美国Sigma公司,蔗糖(sucrose)购自北京欣经科生物技术公司。实验用缓冲液成分为85g/L蔗糖加3g/L葡萄糖溶液,再加入适量的PBS,调节电导率为500S/cm。用电导率仪(TDSTestr,PAKTONInstruments,VernonHills,IL)测量缓冲液的电导率。2.2细胞Jurkat细胞为T细胞淋巴瘤细胞株,从美国AmericanTypeCultureCollection(ATCC)购入。培养于含10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养基中,培养条件为37、5%CO2、饱和湿度。取对数生长期的Jurkat细胞,加入10mol/L阿糖胞苷,然后放入37、5%CO2的孵箱继续培养2、8、24和48h,使细胞发生凋亡。用1.0mmol/L阿糖胞苷处理Jurkat细胞,使其坏死。用0.5g/L台盼蓝鉴定凋亡与坏死细胞。取细胞悬液,离心,用缓冲液清洗两次,以未处理细胞作对照,进行电旋转实验。2.3电旋转检测与数据分析用电旋转芯片(图1)测量细胞的电旋转频谱(电旋转频谱是指细胞的旋转速率对电场频率作图所得的一条曲线)。芯片的电极由4个90相位差的正弦信号驱动。正弦信号的频率范围是1kHz20MHz,由一个信号发生器(自制)产生。细胞悬液(2104/ml)样品(4050l)被加到电旋转芯片上的反应腔里,在反应腔上轻轻地盖上盖玻片。用显微镜(LeicaDMRE,LeicaMicrosystems,Mannheim,Germany)观察细胞。显微镜上装备一

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