豆豉纤溶酶载酶纳米脂质系统的构建与评价

作者:王成涛;籍保平;曹雁平;孙宝国;胡亮 刊名:食品科学 上传者:程彬

【摘要】为提高生物活性酶的生物利用度,以Subtilisin FS33为模式物,研究了硫酸铵梯度法制备载酶脂质体影响其活性和包封的关键因素,探讨了载酶脂质纳米粒的构建及其条件。通过单因素和正交设计试验,确定脂质体制备最佳工艺条件为:胆脂比1:2、硫酸铵浓度为0.15mol/L、孵化温度为45℃、酶脂比1:1。按此条件制备载酶脂质体,其酶活保持率和活性包封率分别为86.6%和30.3%,粒径在50~150nm,属于纳米级单室脂质体。在模拟人工肠液中,载酶脂质体的活力保持较未包被酶有明显提高(p<0.01)。

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多肽及生物活性酶易被水解酶降解,不利于口服吸收,体内半衰期短,如何提高其生物利用度已成为其开发利用的关键问题。脂质体载运系统作为一种新型传递和控释载体,作为多肽、蛋白酶载体显示出诸多优越性[1-5]:增加肠道上皮细胞吸附、延长肠吸收时间,可以跨越生物屏障、能通过人体血液微循环,保护生物活性物质、减少其胃酸和消化道酶分解破坏。脂质体载运系统的制备方法很多[1-4],如硫酸铵梯度法、逆相蒸发法、薄膜分散法、超声波法、加压法等,方法不同制备脂质体的粒径、层次及包封率也不同。李志立[2]用去垢剂透析法制备尿激酶脂质体,包封率约25.6%,其粒径60.413.6nm;Nguyen[4]采用冰冻熔融法对链激酶进行包封,其脂质体粒径13m,其包封率为25%55%。硫酸铵梯度法是一种主动载体系统[5],其原理是通过透析作用使脂质体外水相的硫酸铵浓度下降,产生硫酸铵浓度梯度,进而形成脂质体膜内外的pH梯度,即[H+]lip>>[H+]med。pH梯度使脂质体外水相目的物自发地向脂质体内部聚集(根据Henderson-Hasselbalch理论,每pH单位的变化会产生分子型与离子型物浓度10倍之差);再加上制备时50左右孵化,脂溶性增强,目的物透过磷脂双分子层进入内水相,与硫酸盐结合成复合体,该复合体对双分子层渗透系数很低,从而被保留在内水相,这就是硫酸铵梯度法包封率大大高于被动载体的主要原因。Zhang[6]应用此法取得胰岛素脂质体的包封率达到50%,而其他方法仅为20%左右。SubtilisinFS33是从BacillussubtilisDC33固态发酵豆豉中纯化出的一种单链多肽酶,已证明FS33具有直接溶解血栓和纤溶酶原激活剂的功能[7-8]。为增强其口服吸收效果和体内循环时间,本实验探讨了硫酸铵梯度法制备FS33脂质纳米粒载酶系统的条件,为FS33载酶脂质纳米粒的动物学评价做材料准备。1材料与方法1.1材料与设备蛋黄卵磷脂北京双旋微生物培养基制品厂;牛血清白蛋白(BSAfraction)、考马斯亮兰G-250、TritonX-100、胆固醇北京化学试剂公司。RE-52旋转蒸发器、SHZ-型循环真空泵上海亚荣生化仪器厂;JY92-2D超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司;Citra6紫外可见分光光度计澳大利亚GBC公司;LeminescencespectrometerS5型荧光分光光度计PerkinElmerprecisely公司。SubtilisinFS33是从B.subtilisDC33固态发酵豆豉或发酵液经凝胶层析纯化制得[7]。1.2载酶脂质体制备称取胆固醇和蛋黄卵磷脂无水乙醇和无水乙醚充分混匀溶解50减压蒸发抽干成脂膜一定浓度(NH4)2SO4溶液充分水化冰浴超声(功率450W,20min)0.22m微孔滤膜,整粒加入SubtilisinFS33酶一定温度时间水浴孵化制得靶向载酶脂质体1.3包封率(EncapsulationEfficiency,EE)测定方法按照以上载酶脂质体制备方法,加入一定量酶液(S总酶量)制备载酶脂质体,然后15000g,4下离心15min分离脂质沉淀,取上清液测定其蛋白质含量。其中:S上清液酶量(mg)=蛋白酶浓度C1(mg/ml)上清液体积V1(ml)S总酶量(mg)=酶浓度C2(mg/ml)酶液体积V2(ml)蛋白质浓度测定采用Bradford方法[9],以牛血清白蛋白为标准蛋白,考马斯亮兰为显色剂,595nm测定其OD值。活性包封率测定:将离心分离出的载酶脂质体用3%TritonX-100破膜和超声破碎,释放其

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