Cyclin D1调控肺癌细胞的浸润和转移

作者:李尊岭;邵淑红;焦飞;岳真;马颖 刊名:生理学报 上传者:徐南

【摘要】Cyclin D1作为细胞周期的一个调控因子,许多肿瘤细胞都过表达Cyclin D1基因,比如肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等。但是Cyclin D1在肿瘤细胞浸润和转移中的作用报道较少。本研究旨在研究Cyclin D1对肺癌细胞浸润、转移的调控作用。以肺腺癌细胞A549(高表达Cyclin D1)和肺鳞癌细胞SK-MES-1(低表达Cyclin D1)为研究对象。取裸鼠尾静脉注射A549或SK-MES-1细胞,4周后处死,从肺脏中分离出肿瘤细胞再接种另外的裸鼠,如此经过2次循环接种构建裸鼠高转移动物模型。向A549细胞转染Cyclin D1的干扰RNA抑制Cyclin D1的表达,同时向SK-MES-1细胞转染Cyclin D1的表达载体促进Cyclin D1的表达,随后通过细胞迁移实验观察基因处理后A549和SK-MES-1细胞的转移能力变化。用Western blot检测亲本细胞、不同转移层次裸鼠的癌组织中Cyclin D1和WNT/TCF信号通路相关蛋白因子的表达。结果显示,随着转移次数增加,从动物癌组织中分离出的癌细胞转移能力显著增强,Cyclin D1表达也明显升高;在A549细胞中,干扰Cyclin D1的表达可使细胞迁移能力变弱;在SK-MES-1细胞中,过表达Cyclin D1可使细胞迁移能力增强。高转移肺癌动物模型肿瘤组织中β-catenin、LEF、TCF蛋白表达高于低转移肿瘤组织,而二者的上述蛋白表达均高于亲本肺癌细胞。以上结果提示,Cyclin D1的表达与肺癌的浸润和转移密切相关,推测WNT/TCF信号通路能够促进Cyclin D1的表达。

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肺癌是世界上病死率最高的疾病之一。世界卫生组织最新报道,全球肺癌患者的发病率是120万/年,死亡率是110万/年,而且二者成逐年递增的趋势[1]。肺癌高病死率的一个重要原因是肺癌具有非常高的转移性,往往患者就诊时,已经发生癌细胞转移。据报道肺癌脑转移和骨转移的发生率分别为70%和50%左右[2],即使在早期诊断和外科手术切除癌肿后,患者亦可能在数月内复发,并且出现癌细胞在淋巴结、邻近肺组织、脑和骨的转移。为了对抗肺癌转移,有必要弄清肺癌高转移的分子机制。目前,对于肺癌转移的分子机制,学者们从不同的角度分别进行了大量的研究。有研究显示,转录因子LEF1和HOXB9在肺癌中高表达,促进了转移相关基因的表达,最终导致肺癌脑转移和骨转移[3];还有报道显示,上皮细胞间质化转变(epithelialmesenchymaltransition,EMT)是肺癌高转移的分子基础,而且认为纤维连接蛋白(fibronectin)高表达是上皮细胞间质化的标志性事件,是肺癌转移的第一阶段[4]。细胞周期调控因子CyclinD1和cyclindependentkinase4(CDK4)形成复合物后,使Rb蛋白磷酸化,释放转录因子E2F-1,进而驱动细胞从G1期进入S期。肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌等肿瘤都过表达CyclinD1[5],表明CyclinD1与肿瘤细胞的发生有一定的关系。有研究表明,CyclinD1与肿瘤细胞的黏附、迁移有关系[6]。小鼠成纤维细胞敲除CyclinD1基因后,其运动能力明显减弱,表明CyclinD1与细胞的运动有一定的关系[7],但其具体的作用机制未见报道。WNT/TCF信号通路在干细胞生物学、器官发生、组织分化、肿瘤转移等过程中发挥着重要的作用。当WNT配体与Frizzle受体结合后,泛素磷酸化,释放-catenin蛋白。-catenin进入细胞核并聚集,结合转录因子LEF/TCF,促进下游结构基因的表达[8]。本研究以肺腺癌细胞A549(高表达CyclinD1)和肺鳞癌细胞SK-MES-1(低表达CyclinD1)为研究对象,建立肺癌高转移动物模型,构建CyclinD1干扰RNA和表达载体并转染细胞,采用细胞迁移实验和Westernblot进行研究,以期明确CyclinD1对肺癌细胞迁移的影响,及其与WNT/TCF信号通路的联系。1材料和方法1.1细胞及试剂本研究所用的人肺腺癌细胞A549细胞株、pcDNA3.1(+)载体由本研究所保存,肺鳞癌细胞SK-MES-1购自中科院上海细胞库。1640培养基、MEM培养基、胎牛血清由Hyclone公司提供。CyclinD1、-catenin、LEF、TCF、GAPDH抗体由SantaCruzBiotechnology公司提供。T4DNA连接酶、EcoRI内切酶、HindIII内切酶均购自Fer-ments公司,胶回收试剂盒购自大连宝生物生物技术有限公司。Lipofectamine2000Reagentkit购自In-vitrogen公司,Transwell试剂盒购自BD公司。细胞培养条件:A549细胞,1640完全培养基(添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素);SK-MES-1细胞,MEM完全培养基(MEM加10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素)。A549和SK-MES-1细胞均在37C、5%CO2培养箱中培养。1.2转移动物模型的构建24只5周龄的Balb/c裸鼠(由山东大学实验动物中心提供)随机被分为两组,一组为A549细胞组(命名为A组),另

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