Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达

作者:姚冬静;舒莉萍;何志旭;马建娟;李涛;黄惠敏 刊名:第二军医大学学报 上传者:王昭昭

【摘要】目的为了深入了解在胚胎发育过程中,尤其是在早期B淋巴细胞的生成和中脑的发育过程中pax5基因可能的作用及其机制,选择斑马鱼作为实验动物,构建野生型斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,并观察pax5基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达。方法提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后,在T4DNA连接酶的作用下插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。将得到的探针用全胚胎原位杂交技术检测pax5基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。结果成功构建pCS2+-pax5重组质粒并制备了pax5基因的反义mRNA探针,通过斑马鱼原位杂交技术,发现在斑马鱼受精后18~72小时(18~72hpf)胚胎头部的小脑、中脑后脑交界处均可观察到pax5基因阳性杂交信号;在24~72hpf胚胎的耳蜗均可观察到pax5基因的阳性杂交信号,且随着时相的增长其表达逐渐增多;在18~48hpf胚胎的脊索部位可见pax5基因的阳性杂交信号。结论明确了pax5基因在斑马鱼胚胎的脑部、脊索神经系统高表达,并首次证实其在耳蜗听神经的早期发育过程中有表达,可能对斑马鱼早期胚胎神经系统的发育起着某些至关重要的作用。

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Pax5是pax基因家族中研究最多的成员之一,主要在胚胎发育过程中表达,尤其是在早期B淋巴细胞的生成和中脑的发育起着重要的作用[1],但是pax5基因在这一过程中的作用以及分子机制至今并不十分清楚,为了深入地了解这一机制,我们选择了斑马鱼作为实验动物进行了初步研究。本研究通过构建并鉴定pCS2+-pax5重组质粒,体外转录表达斑马鱼pax5基因反义mRNA探针,并运用全胚胎原位杂交技术检测了斑马鱼pax5基因在野生型斑马鱼发育过程中的表达情况,从三维、立体视角观察pax5基因在造血发育早期尤其是B淋巴细胞的形成以及发育过程中的表达和可能的作用。1材料和方法1.1实验动物野生型Tuebingen斑马鱼由上海生命科学院健康研究所刘廷析研究员馈赠,在本实验室繁殖培育,养殖条件:(282),用带有过滤系统的循环水系统养殖,12h/d光照。1.2菌株及质粒PCR引物由北京诺赛基因组研究中心合成;E.coliDH5由本课题组保存;pCS2+质粒载体由上海生命科学院健康研究所刘廷析研究员馈赠。1.3酶类及其他试剂TRIzol试剂、反转录试剂First-strandplus购自Invitrogen公司,高保真KOD-PlusPCR酶购自Toyobo公司,限制性内切酶EcoR、Xba、T4DNA连接酶和DNAmarker均购自Fermentas公司;质粒小量抽提试剂盒购自Axygen公司;DNA凝胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司;地高辛RNA标记和检测试剂盒、NucAwayTMSpinColumns购自Ambion公司;BCIP/NBT购自VectorLab公司。1.4cDNA的合成收集0.7572hpf(hourspost-fertilization,受精后小时)多个时相的斑马鱼胚胎脱卵膜后置于1.5ml的Eppendorf管中,加入1mlTRIzol充分匀浆处理,室温静置5min,经氯仿、普鲁泊福、75%乙醇洗涤沉淀晾干后,加入适量DEPC水溶解。将提取的总RNA利用Super-ScriptTMFirst-strandSysthesisSystem试剂盒的随机引物进行反转录,反应在AG22331型热循环仪(Eppendorf公司)上按试剂盒说明书进行操作。1.5斑马鱼pax5基因编码序列的PCR扩增根据斑马鱼pax5基因的mRNA序列(BC129478),同时引入EcoR、Xba酶切位点以及保护碱基,设计pax5序列的引物,上游引物P1:CGGAATTCCCTCCCTCACTGGAATGGTA,下游引物P2:GCTCTAGACGTGTGGCTGCGCTATAGTA。RT-PCR扩增条件:cDNA合成4030min,94预变性2min,94变性30s,68退火30s,72延伸2min,共30次循环,最后延伸7210min。PCR产物大小为228bp。以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。1.6斑马鱼pax5基因的克隆及序列分析将pCS2+质粒利用钙转法转入E.coliDH5感受态菌中,通过氨苄抗性筛选出阳性克隆,扩增后运用碱裂解法提取pCS2+质粒DNA后,用EcoR以及Xba双酶切,行1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。将pax5基因的PCR产物用EcoR以及Xba双酶切,行1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收,将回收产物与上述得到的经EcoR及Xba双酶切的pCS2+质粒在T4DNA连接酶的作用下相连接,将连接产物运用钙转法转入E.coliDH5感受态菌中,运用氨苄抗性筛选出阳性克隆并扩增后,运用碱裂解法提取pCS2+-pax

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