清热化瘀方对脑缺血预处理大鼠GADD34表达的影响

作者:胡跃强;唐农;董少龙;刘尊敬;祝美珍;胡玉英;陈炜 刊名:中药新药与临床药理 上传者:温兴培

【摘要】目的观察清热化瘀方对脑缺血预处理大鼠缺血再灌注后生长停滞与DNA损害可诱导基因34(GADD34)mRNA及其蛋白表达的影响。方法 SD大鼠160只,随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血预处理组、清热化瘀方组,每组按照再缺血后12 h、1 d、2 d、3 d 4个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用原位杂交法和Western blot法观察再缺血后各个时间点GADD34 mRNA及其蛋白的表达变化。结果脑缺血再灌注组12 h GADD34 mRNA及其蛋白表达均达高峰,随再灌注时间延长其表达逐渐下降(P<0.05,P<0.01);缺血预处理组GADD34mRNA及其蛋白表达较缺血再灌注组均明显升高(P<0.05,P<0.01);清热化瘀方组较脑缺血预处理组进一步升高其表达(P<0.05,P<0.01)。结论脑缺血预处理可能通过诱导GADD34表达发挥其神经的保护作用,清热化瘀方可进一步促进其神经保护作用。

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脑缺血预处理(brainischemicpreconditioning,BIP)是近年发现的重要内源性神经保护机制,可使脑组织对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受。最近有研究发现内质网应激(endoplasmicreticu-lumstress,ERS)在此环节中发挥了关键作用。生长停滞与DNA损害可诱导基因34(growtharrestandDNAdamage-inducibleprotein34,GADD34)是一种细胞周期蛋白,它在内质网功能障碍等情况下可表达上调,是ERS后蛋白质合成功能恢复的关键性分子。清热化瘀方药理作用机制提示其可能促使预处理后延迟性脑缺血耐受的产生[1],但其机制有待于阐明。本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血预处理模型,从ERS角度观察清热化瘀方联合BIP对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,为临床缺血性脑卒中的治疗和二级预防提供依据。1材料与方法1.1材料雄性SD大鼠160只,SPF级,体质量(25050)g,广西医科大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK桂2009-0002;HMIAS-2000高清晰彩色病理图像分析系统,武大影像工程公司;Bio-Rad垂直板式电泳槽仪,美国;兔抗GADD34抗体,美国santacruz公司;偶联有辣根过氧化物(HRP)羊抗兔IgG,Amersham公司。1.2药物制备清热化瘀方(水牛角、丹参、赤芍、地龙、石菖蒲等10味中药组成)单味中药浓缩颗粒剂,江苏省江阴市江阴天江药业有限公司,批号:0904099。给药容积为14mL/kg,其等效剂量按体表面积折算为14gkg-1d-1。1.3动物模型的制备采用大脑中动脉二次线栓法[2]制备大鼠脑缺血预处理模型,结扎大鼠左颈外动脉远端和颈总动脉近端,将前端用火焰烧圆的尼龙线从颈总动脉残端插入,进线约18~20mm,大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)后10min抽出线栓,完成预缺血。3d后再次行MCAO2h,规定时间点处死动物取脑。1.4分组及处理雄性SD大鼠160只,随机分为4组:假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血预处理组、清热化瘀方组。每组按照再灌注后12h、1d、2d、3d%4个时间点平均分为4个亚组(n=10),分别作如下处理。脑缺血预处理组:MCAO10min后抽出栓线,完成预缺血,3d后再次行MCAO2h,再灌注后12h、1d、2d、3d处死大鼠。清热化瘀方组:缺血预处理10min后,在大鼠麻醉清醒后1h灌胃清热化瘀颗粒溶液,连续3d,每天上、下午各1次。3d后给予2hMCAO,再灌注后12h、1d、2d、3d处死大鼠。假手术组以假手术代替预缺血及缺血再灌注,线栓只插入颈内动脉9mm。脑缺血再灌注组以假手术代替预缺血,线栓只插入颈内动脉9mm,其余步骤同脑缺血预处理组。1.5缺血半暗带脑皮质GADD34mRNA表达测定原位杂交法,按试剂盒说明进行操作。采用HMIAS-2000高清晰彩色病理图像分析系统测定GADD34mRNA原位杂交染色的灰度值。主要在顶叶缺血半暗带阳性细胞做比较,染色越深,灰度值越小,mRNA表达越多。每张切片测定4个视野(400),取平均值。1.6缺血半暗带脑皮质内GADD34蛋白表达测定大鼠迅速断头取脑,冰上分离缺血侧顶叶大脑皮质约100mg,冰上研磨组织后加预冷的蛋白裂解液,继续碾磨至液态,然后4,12000r/min离心30min,留上清液,取40L用BCA法进行蛋白定量测定,所剩上清液按41的比例加变性loading,100水浴10min。取蛋白样品(40

参考文献

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