罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测法的建立及应用研究

作者:钱冬;刘问;潘晓艺;曹铮;于涟 刊名:浙江大学学报(农业与生命科学版) 上传者:李安妮

【摘要】罗氏沼虾肌肉白浊病(Whitish muscle diseases ofMacrobrachium rosenbergii)是近年来流行于罗氏沼虾苗种阶段的严重疾病,该病病原已确定为罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergiiNodavirus,MrNV).作者在病毒超离提纯的基础上,制备了罗氏沼虾诺达病毒兔抗血清,并应用抗罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体2B5,建立了三抗体夹心酶联免疫检测方法(TAS-ELISA).TAS-ELISA最适反应条件为:兔抗体以1μg/mL包板,小鼠单抗2B5的工作浓度为1∶50000,该法检测MrNV的灵敏度达0.98 ng,对WSSV、TSV及其他细菌感染死亡的罗氏沼虾苗没有非特异性反应.通过对2000—2002年病虾及疑似病虾的病毒检测,表明TAS-ELISA法比间接ELISA法和核酸电泳法有更高的阳性检出率和符合率;此外还摸索了降低孵育温度和缩短孵育时间对病毒检测的影响,表明各步孵育温度和时间分别为25℃和20 min对于白浊症状的病苗检测无明显影响,使得本法更加适合于生产实践.

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罗氏沼虾肌肉白浊病(WhitishmusclediseasesofMacrobrachiumrosenbergii)是近年来流行于我国罗氏沼虾主要养殖省市的疾病,主要危害罗氏沼虾虾苗,患病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,导致病虾大量死亡,严重时可高达60%~100%,是近年来罗氏沼虾育苗和养殖的主要疾病[1].作者前期工作表明该病的病原为罗氏沼虾诺达病毒(M.rosenbergiiNodavirus,MrNV)[2].到目前为止,该病毒仅发现于肌肉白浊病的罗氏沼虾虾苗中,从发病情况及流行病学分析,该病由亲虾传播的可能性极大,带病毒苗种的跨地区运输和带病毒种虾的使用,是造成该病迅速传播扩散的重要原因.目前对罗氏沼虾诺达病毒还没有方便、特异、灵敏的检测方法,使得罗氏沼虾的健康苗种检测和检疫不能得到可靠的技术支持.近年来,作者在罗氏沼虾病毒分离鉴定后,开展了病毒抗血清和小鼠单克隆抗体的研制工作,在此基础上,开展了病毒的检测技术研究,建立了TAS-ELISA法,本文报道这一研究结果.1材料与方法11实验材料提取病毒用罗氏沼虾发病虾苗,取自浙江省湖州市发病苗场,规格为007g?尾-1,呈典型肌肉白浊病症状,-20冰冻保存备用;制备抗血清用新西兰大白兔购自浙江省医科院实验动物中心,体重18kg;福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购自Sigma公司;抗罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体为本实验室制备;纯化对虾白斑综合症病毒(WSSV)由武汉病毒所石正丽研究员提供,对虾桃拉综合症病毒(TSV)取自桃拉病检测阳性南美白对虾;辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体购自上海华美生物公司.12罗氏沼虾诺达病毒的提取参照文献[2].13兔抗病毒血清的制备新西兰大白兔饲养两周后进行免疫,将提纯病毒与等体积福氏完全佐剂充分混合后进行皮下、皮内、肌肉和脚掌多点注射,免疫剂量为50g;首次免疫后第15d、第30d分别以提纯病毒加福氏不完全佐剂进行多点加强免疫;第45d耳静脉注射100g提纯病毒,第60d颈动脉放血.以提纯罗氏沼虾诺达病毒1g?mL-1包板,间接ELISA法测定血清效价.血清分装后,-20冻存备用.14鼠抗诺达单克隆抗体的制备用提纯病毒免疫BALB/C小鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,得到12株能特异分泌抗MrNV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞.注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为(1105)~(1106).挑选效价高的腹水单抗2B5,用于罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测[3].1.5TAS-ELISA操作步骤基本按文献报道方法[4],简述如下:兔抗血清以50%饱和硫酸铵沉淀法作初步提纯,用Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释抗体,每孔加入100L抗体,37包被1h,再4过夜;以PBST冲洗包被板后,以05%BSA封闭371h;依次加入病毒样品、抗病毒单抗、辣根过氧化酶标记羊抗小鼠抗体孵育,各步孵育时间为371h,孵育结束后以PBST冲洗3次以上;以邻苯二胺显色后加浓硫酸终止反应,测定OD490.16最佳工作浓度的确定分别以不同浓度兔抗体包被酶标板及使用不同浓度的小鼠单抗,摸索TAS-ELISA的最佳工作浓度.1.7TAS-ELISA的特异性测定以提纯对虾白斑综合症病毒(WSSV)、患桃拉病南美白对虾、有类似肌肉白浊病症状的种虾、育苗池死亡罗氏沼虾苗等,按TAS-ELISA法测定其非特异性反应.1.8TAS-ELISA灵敏度的测定将提纯罗氏沼虾诺达病毒从10g?mL-1开始,用PBS作4倍系列稀释,以健康罗氏沼虾组织

参考文献

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