牛黄镇惊丸对斑马鱼胚胎发育的影响

作者:刘静;张靖溥;孟杰;戴忠;马双成; 刊名:药物评价研究 上传者:钱理群

【摘要】目的 研究牛黄镇惊丸对斑马鱼胚胎发育的影响.方法 以斑马鱼胚胎为实验对象,体视光学显微镜下观察牛黄镇惊丸不同给药浓度(40、200、400、800、1 200 μg/mL)时斑马鱼胚胎的发育情况,包括胚胎致畸、致死检测.结果 给药浓度不高于200 μg/mL时,未见胚胎发育异常.浓度高于200 μg/mL(约相当于成人用量30倍,远超出正常有效剂量)时对胚胎发育具有一定的毒性,胚胎出现头和眼发育较小,瞳孔无色;心脏畸形、心率较弱、血池充血-回心血流不畅;腹部透明度较差、尾干扭曲,卵黄囊延伸结构变粗,脊索变细,无正常胚动,体长变短;撤药后畸形表型未见恢复,且毒性呈浓度相关性;半数致畸浓度(TD50,受精后3 d)约373 μg/mL,半数致死浓度(LD50)约为485 μg/mL.浓度为1 200 μg/mL时,胚胎在受精后1d之内全部死亡.结论 牛黄镇惊丸给药浓度大于200 μg/mL时影响斑马鱼胚胎发育.其毒性作用发生在胚胎器官形成期,主要对胚胎的神经系统、心血管系统和骨骼等发育有影响.

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牛黄镇惊丸是由牛黄、天麻、防风、人工麝香、钩藤、朱砂、雄黄、甘草等18味药组成的中药复方制剂,具有镇惊安神、祛风豁痰的功效,现行标准收载于《中国药典》2015年版一部[1]。现有研究主要围绕处方中牛黄、麝香以及天麻等药味化学成分展开[2-3],无相关毒性研究报道,而处方分析显示其中含有朱砂、雄黄两味矿物药,其毒性一直被广泛关注,因此有必要开展毒性相关研究,为其临床安全使用提供科学的数据支持。斑马鱼作为一种新的模式动物,近些年来在国内外引起广泛关注。由于斑马鱼胚胎在母体外发育,发育时间短、数量多,胚胎通体透明,用简单的光学显微镜就能观察组织器官发育情况,因此,斑马鱼模型具有实验快速、高效等优势[4-5]。此外,报道表明,斑马鱼与高等脊椎动物人类、小鼠的基因同源性达60%~80%[6-8],且其对药物反应与人类临床反应相似[9-10]。因此,斑马鱼是作为评价药物毒性研究的理想模型[11-13]。本试验以斑马鱼胚胎为观察对象,通过考察牛黄镇惊丸对其发育的影响及胚胎畸形率、死亡率的检测来探讨其急性毒性作用,为本品安全性提供初步的数据支持,同时也可为中药毒性评价进行有益的尝试与参考。1.1实验动物实验所用斑马鱼(Daniorerio)为野生型(wildtype,WT)TU品系,由北京大学生命科学学院张博教授惠赠,养殖于(28.51)的人工海水中,繁殖方法参照文献进行[11]。1.2药物及主要试剂牛黄镇惊丸样品(规格1.5g/丸,批号16013047,试验样品为其加蜜制丸前粉末状样品;由18味中药组成,涵盖常见天然产物种类以及矿物药成分,现行标准见《中国药典》2015年版一部[1]),来自中国食品药品检定研究院;乙醇为分析纯,购于国药化学试剂有限公司;水为超纯水、人工海水(反渗水配制);高级海水晶,购于天津中盐海洋生物科学有限公司。1.3主要仪器METTLERXS105型电子分析天平(瑞士Mettler公司);Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司);KQ-300DA型数控超声波清洗仪(中国昆山市超声仪器有限公司);奥林巴斯SZ61体式显微镜(日本Olympus公司)。2.1斑马鱼饲养与繁殖斑马鱼养殖于(28.51)的斑马鱼饲养液中,繁殖方法参考文献[11]进行。2.2药物配制及给药浓度预实验由于一般水溶性成分除大分子之外,均可溶于稀醇,为去除制剂中淀粉等类大分子成分,有利于斑马鱼给药,本研究采用70%乙醇提取,样品经70%乙醇超声提取,过滤,滤液蒸干,取适量,以斑马鱼饲养液为溶剂配制母液约40mg/mL,保存于-20。选取早期胚胎,进行多组给药处理,经预实验确定稀释成40、200、400、800、1200g/mL工作液。2.3指标检测显微镜下选取正常发育的受精后6h左右的胚胎30枚,置5mL玻璃皿中,分别浸入各测试液中,置于标准环境下使之发育,当胚胎发育至第3天时,换入正常饲养液中继续发育观察直至第5天。以在斑马鱼饲养液中发育的胚胎为对照组,在体视光学显微镜下于受精后24、48、72、96、120h观察记录胚胎发育情况,如脑、眼、心、血流、躯干(脊索/神经管、体节)、胚体生长速度、游动及对刺激的反应能力等(包括统计发育第3天的畸形和死亡数/存活胚数),直至实验结束。每个浓度测试液平行检测至少3次。2.4数据处理采用Excel进行数据处理,畸形率和死亡率以来xs表示,制作柱状图。采用概率单位法,计算半数致畸剂量(TD50)和半数致死剂量(LD50)。3.1对斑马鱼胚胎发育影响的观察结果显示,在不大于200g/mL时,未见胚胎发育异常,200

参考文献

引证文献

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