神经细胞黏附分子对小鼠骨髓间充质干细胞黏附、迁移及细胞形态的影响

作者:毕佳佳;王磊;李静;丁琼琼;冯志伟; 刊名:基础医学与临床 上传者:崔冬梅

【摘要】目的 探讨神经细胞黏附分子(NCAM)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、迁移及细胞形态的影响.方法 从野生型小鼠和NCAM基因敲除小鼠中分离、培养BMSCs,Western blot和免疫荧光标记检测NCAM的表达;划痕实验和黏附实验分别检测细胞迁移和黏附能力;倒置显微镜下观察细胞形态;Western blot检测β1整联蛋白、E-cadherin、β-catenin和N-cadherin的表达.结果 NCAM基因敲除后细胞的迁移能力和黏附能力明显降低,β1整联蛋白的表达下调(P<0.01),BMSCs形态由不规则形变为扁平形,且成簇增殖,上皮细胞标记蛋白E-cadherin和β-catenin的表达显著上调(P<0.05),而间质细胞标记蛋白N-cadherin的表达下调(P<0.01).结论 NCAM通过调控β1整联蛋白的表达影响BMSCs的黏附和迁移,同时NCAM可能对BMSCs的间质上皮转化起负调控作用.

全文阅读

神经细胞黏附分子(neuralcelladhesionmolecule,NCAM)属于免疫球蛋白超家族成员,广泛表达于神经细胞,在自然杀伤细胞、骨骼肌细胞、间充质干细胞及肿瘤细胞等多种其他类型细胞中也有表达,主要介导细胞与细胞、细胞与基质的黏附,并能作为功能受体活化多种胞内信号分子,调控细胞骨架结构及分布的改变[1-2],最终调节细胞的增殖、分化和迁移。骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesen-chymalstemcells,BMSCs)是一类非造血干细胞,能够自我更新和分化为多种细胞类型。此外,BMSCs具有感知损伤信号并移出骨髓到达损伤部位参与组织修复和重建的功能[3],且易于获取、体外扩增快、便于移植。因此,在创伤修复、组织和器官重建过程中具有广泛的临床意义,但其修复机制一直备受争议。研究显示,间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)能够分化为多种上皮细胞,参与肺、小肠等上皮组织修复[4]。而MSCs的迁移是其成功到达损伤部位进行组织修复的重要前提,趋化因子、旁分泌因子、膜受体及胞内信号分子等多种重要分子机制参与MSCs的迁移过程[5]。本研究探讨膜蛋白NCAM在BMSCs迁移和上皮细胞转化中的作用,并简要阐明其相关作用机制。1材料与方法1.1材料1.1.1试剂:DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司);荧光染料CFSE(日本株式会社同仁化学研究所);鼠抗NCAM抗体(SantaCruz公司);鼠抗actin抗体(Sigma-Aldrich公司);兔抗E-cadherin抗体(CellSignalling公司);兔抗-catenin和N-cadherin抗体(万类生物公司);兔抗1整联蛋白抗体(上海生工);辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG(北京中杉公司);ECLPlus免疫杂交化学反应试剂(AmershamBiosciences公司)。1.1.2动物及细胞:NCAM基因敲除小鼠、野生型BMSCs(WT)和NCAM基因敲除BMSCs(NCAM-/-)由本实验室制备并保存。1.2方法1.2.1分离与培养WT和NCAM-/-BMSCs:反复冲洗野生型小鼠和NCAM基因敲除小鼠的股骨骨髓获得BMSCs,具体方法依据参考文献[6]。当贴壁细胞增殖至汇合率达90%时进行传代培养。1.2.2Westernblot检测蛋白表达:预冷的PBS洗WT和NCAM-/-BMSCs各3次,加入裂解缓冲液,冰上静置30min,超声破碎细胞30s,12000g离心30min,取上清进行SDS-PAGE分离。之后将蛋白转移到PVDF膜上,3%BSA封闭1h,一抗室温孵育1h,PBST漂洗10min3次,相应的二抗室温孵育1h,PBST漂洗10min3次,ECL避光显色曝光。结果用ImageJ软件进行吸光度值分析。1.2.3免疫荧光检测NCAM表达:将WT和NCAM-/-BMSCs加入到铺有玻片的24孔培养板中,过夜培养后10%甲醛室温固定细胞10min,PBS洗10min3次。0.1%TritonX-100室温透化3min,PBS洗10min3次。3%BSA室温封闭1h,PBS洗10min3次。一抗室温作用1h,PBS洗10min3次。二抗室温避光作用1h,PBS洗10min3次。DAPI标记细胞5min,PBS洗10min3次。90%甘油封片,倒置荧光显微镜观察拍照。1.2.4划痕实验检测细胞迁移能力:将WT和NCAM-/-BMSCs铺在24孔培养板中培养,待细胞汇合至100%时,用10L枪头在培养板

参考文献

引证文献

问答

我要提问