BKR基因启动子鉴定及表达调控

作者:潘琳;褚春旭;李梓文;孙基丰;张昊; 刊名:长春理工大学学报(自然科学版) 上传者:黄霄

【摘要】BKR基因是睾丸酮丛毛单胞菌中的一个重要的甾体化合物降解酶基因,TetR、LysR和LuxR蛋白是睾丸酮丛毛单胞菌中的调控蛋白.以EGFP为报告基因,构建pK-BKR-EGFP质粒,通过与pK-EGFP分别转化到大肠杆菌JM109,检测荧光信号,确定预测的序列中包含BKR基因的启动子.然后通过质粒共转化技术,检测TetR、LysR和LuxR蛋白与pK-BKR-EGFP的荧光信号强度,探讨TetR、LysR和LuxR三个蛋白与BKR基因之间的调控关系.实验结果表明:BKR基因的启动子在该基因前699bp内;LysR与BKR基因共转后荧光信号增强;TetR和LuxR分别与BKR基因共转后荧光信号减弱.由此可以得出结论,LysR对BKR基因的调控起增强作用;TetR和LuxR对BKR基因的调控起抑制作用.该实验揭示了睾丸酮丛毛单胞菌中BKR基因的调控序列,为CT菌利用甾体激素作为唯一的碳源及能源机理提供理论基础.

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甾体类化合物对生态环境的污染日趋严峻,引发人和动物的一系列不良的生理反应[1,2]。睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996(ComamonastestosteroniATCC11996)具有降解多种甾体激素的能力[3],在降解环境中甾体激素污染上具有很高的应用价值[4],使人类能够避免一些环境中类固醇激素对人健康的危害。对睾丸酮丛毛单胞菌早期研究发现几个类固醇代谢酶[5,6,7],对类固醇代谢起关键作用[8]。BKR基因通过DNA序列分析表明,属于短链脱氢酶(SDR)家族,并参与脂肪酸的合成。先前的研究表明,BKR基因是睾丸酮丛毛单胞菌降解激素所必须的基因[9]。TetR[10]、LysR[11,12]和LuxR[13]基因是菌体中的一种调控基因,可能对BKR基因具有调控作用,但目前尚未有明确的认识。为深入了解TetR、LuxR和LysR基因对BKR基因的调控作用,该实验构建了以增强绿色荧光蛋白(Enforcementgreenfluorescenceprotein,EGFP)[14]为报告基因的启动子鉴定质粒,并在此基础上明确了TetR、LuxR和LysR基因对BKR基因的调控作用。以期了解BKR基因的调控基因,进一步了解睾丸酮丛毛单胞菌的调控模型。1材料与方法1.1材料质粒pK-EGFP及睾丸酮丛毛单胞菌由德国基尔大学熊光明教授赠送。质粒Puc19、Puc-TetR、pET15b、pET-LuxR及pET-LysR为长春理工大学实验室所保存。pUC18-T,连接酶及PCR反应所以试剂均为Takara公司产品。限制性内切酶SalI,BamHI及buffer为Thermo公司产品。质粒小量抽提试剂盒及胶回收试剂盒为上海生工产品。JM109菌株为promega公司产品。其他常用试剂为实验室自行配制。1.2方法1.2.1带EGFP报告基因的启动子鉴定质粒pK-BKR-EGFP的构建如图1所示,通过PCR及TA克隆构建BKR-T质粒,用限制性内切酶SalI和BamHI对pK-EGFP和BKR-T进行双酶切,分别回收大片段和小片段,以T4DNA连接酶连接后获得质粒pK-BKR-EGFP。图1质粒Pk-BKR-EGFP构建路线图1.2.2BKR-T质粒的构建1.2.2.1引物设计与合成根据睾丸酮丛毛单胞菌基因组序列,设计合成一对扩增引物。上游引物为5’-GTCGACCAGC-GACCAGCTGCTGCAAAAG-3’,含有SalI酶切位点;下游引物为5’-GGATCCTGCT-GTCTCCTTGGGTGCG-3’,含有BamHI酶切位点。扩增产物为BKR-699bp片段。引物有吉林省库美生物科技有限公司合成。1.2.2.2PCR扩增反应体系:25l,2xTaqMasteMix,上下游引物(10pmol/l)各1l,睾丸酮丛毛单胞菌模版1l,ddH2O补足至25l。反应条件为:94预变性10min;94变性45s,58退火45s,72延伸50s,循环35次后72延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳,观察并成像。1.2.2.3质粒构建PCR产物经胶回收后与pUC18-T进行连接。连接产物转化到感受态JM109细菌内,接种至LB平板,37过夜培养。1.2.2.4克隆鉴定挑取LB平板上生长的单个菌落至LB液体培养基,37,180rpm/min震摇培养16h,取1.5ml细菌用质粒小量抽提试剂盒提取质粒,并进行序列分析。DNA序列分析由吉林省库美生物科技有限公司完成。1.2.3pK-BKR-EGFP基因的构建使用SalI和BamHI将BKR-T和pK-EGFP进

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