液相色谱-串联质谱生物分析方法的基质效应和对策

作者:刘晓云;陈笑艳;钟大放; 刊名:质谱学报 上传者:秦永坚

【摘要】液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法具有高灵敏度、高选择性、高通量等特点,已经成为生物分析的主流方法,广泛应用于新药发现和开发过程中新化学实体及其代谢物的定量分析.然而,由于生物样品基质成分复杂,共洗脱物质会影响分析物的离子化,使分析物的质谱响应增加或降低,从而影响LC-MS/MS分析方法的准确度和精密度.一般而言,离子抑制较离子增强更为常见.因此,在建立LC-MS/MS法时,需要对离子抑制进行评估和校正,并采用不同的策略消除或减少基质效应的影响.本文综述了生物样品分析中基质效应的来源和评估方法,重点介绍了克服基质效应的策略.引起基质效应的物质包括磷脂、盐类、尿素、代谢物等内源性物质和赋形剂、抗凝剂、固定相释放物质及降解产物等外源性物质.目前基质效应的评价方法主要有提取后加入法和柱后灌注法.克服基质效应的策略主要有使用稳定同位素内标,将极性药物衍生化,沉淀蛋白后稀释上清液,优化样品预处理方法、色谱和质谱条件等.结合本课题组的应用实例,重点阐述了建立LC-MS/MS生物分析方法时,为减少基质效应遇到的困难及解决方法.

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液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)于20世纪90年代发展成熟,在灵敏度、选择性、分析通量以及对药物分析的适用性等方面有非常突出的优势,特别适用于复杂基质(如血浆)中微量药物及代谢物的定量分析,是近20年来生物分析的主流技术。然而,基质效应是该技术用于生物样品定量分析中最突出的问题。在分析过程中,共洗脱物质会影响分析物的离子化,这种现象称为基质效应。基质效应分为离子抑制和离子增强,离子抑制使分析物的质谱响应降低,而离子增强则使分析物的质谱响应增加。一般而言,离子抑制较离子增强更易发生。基质效应会影响分析物的检出限、定量限、线性、准确度和精密度,严重干扰了生物样品的定量分析。因此,在建立LC-MS/MS生物分析方法时,应对基质效应进行评估,并采取适宜的方法消除或减少基质效应的影响,从而确保数据的可靠性。本工作根据课题组近年来从事药代动力学研究的经验,综述LC-MS/MS分析测定中基质效应的来源、评估方法、克服基质效应的策略,并通过研究实例加以阐述,希望为克服LC-MS/MS生物分析方法的基质效应提供参考。1基质效应的来源和评估方法采用LC-MS/MS分析测定时,生物样品中的内源性物质或外源性物质会影响分析物的离子化或去溶剂化过程,使分析物的质谱响应增加或降低,从而产生基质效应。内源性物质是样品基质的一部分,如蛋白质、磷脂、盐类等;外源性物质可能是色谱系统中的一部分,如缓冲液,或在样品预处理过程中引入的物质,如塑化剂[1]。研究发现,磷脂是产生基质效应的主要内源性物质,它能够严重抑制许多化合物的质谱响应,且较难从生物样品中去除[2-4]。在生物基质中,主要有甘油磷脂和鞘磷脂两种类型的磷脂,前者包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺等,在不同受试者和不同采样时间点时,它们的浓度差别很大。在大部分人的血浆和尿液中,最常见的磷脂类型为卵磷脂[5]。检测和评估基质效应主要有提取后添加法和柱后灌注法。提取后添加法以内标归一化的基质因子定量基质效应,在相同浓度下,通过计算存在基质时(由空白基质提取后加入分析物)与不含基质时(分析物的纯溶液)分析物信号的比值来获得基质因子。若基质因子大于1,说明存在离子增强;若基质因子小于1,说明存在离子抑制。用分析物的基质因子除以内标的基质因子来计算内标归一化的基质因子[6]。柱后灌注法主要用于定性评估基质效应,具体流程示于图1[7]。通过注射泵将分析物的标准溶液注入,然后经T形管引入到色谱柱流出液中;将空白基质样品注入系统(同时连续灌注分析物),并使用开发的分析方法在色谱柱上分离空白基质样品;若分析物的基线信号下降(信号抑制)或升高(信号增强),说明存在基质干扰。图1柱后灌注实验的设置示意图Fig.1Schematicoftheset-upofapost-columninfusionexperiment2克服基质效应的策略2.1使用稳定同位素内标内标与分析物暴露在相同的基质成分中,使用分析物与内标的响应比值进行定量可以校正可能存在的基质效应,减少分析过程中基质效应的影响。对于LC-MS/MS法而言,稳定同位素内标(SIL-IS)是最合适的。SIL-IS是由分析物分子中的原子被它们的稳定同位素,如2H、13C、15N、18O取代后获得的。SIL-IS在样品预处理、色谱分离、质谱离子化和裂解过程中,与分析物几乎一致。因为SIL-IS与分析物的保留时间很接近,基质对它们的影响是相同的,所以使用SIL-IS是克服基质效应最简便的方法。但合成SIL-IS的难度较大,尤其是对多个分析物同时定量时,需要多个相应的SIL-IS。选择合适的

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