GLUT4和脂联素在3T3-L1脂肪细胞中共享囊泡转运机制

作者:崔菊;庞静;宫环;蔡剑平;张铁梅; 刊名:医学研究杂志 上传者:包清涛

【摘要】目的 观察葡萄糖转运蛋白GLUT4和脂联素在3T3-L1细胞中的亚细胞分布.方法 诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,比较细胞分化前后GLUT4和脂联素的表达情况;通过蔗糖密度梯度离心比较GLUT4囊泡和脂联素囊泡的密度;采用结构照明超高分辨率显微镜(3D-SIM)观察GLUT4和脂联素在3T3-L1脂肪细胞内的分布情况.结果 3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞质内无脂滴,细胞分化成熟后呈圆形,胞质内含有大量脂滴;GLUT4和脂联素在3T3-L1前脂肪细胞中不表达,在分化成熟的脂肪细胞中高表达;GLUT4囊泡和脂联素囊泡具有相似的密度;GLUT4和脂联素在细胞中共定位.结论 GLUT4和脂联素在3T3-L1脂肪细胞中分布于相似的细胞囊泡结构,共享转运机制.

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随着人们生活方式的改变和人口老龄化,肥胖和2型糖尿病已经成为危害人类健康和生活质量的主要疾病。研究表明,脂肪组织不仅是一个被动的储存能量的器官,它还是一个调节机体内分泌、能量代谢及炎症的内分泌器官。葡萄糖转运蛋白GLUT4是一种膜蛋白,在胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中表达。胰岛素刺激激发一系列级联反应,导致富含GLUT4的囊泡从细胞内向细胞外膜移动,GLUT4转位至细胞外膜,与葡萄糖结合并将葡萄糖转运至细胞内。当循环胰岛素水平下降时,GLUT4通过吞饮作用从细胞外膜内吞到胞内储存囊泡中,从而保持血糖平衡[1]。在小鼠脂肪组织中特异性敲除GLUT4导致小鼠肌肉和肝脏胰岛素抵抗,表明脂肪细胞GLUT4水平的降低可继发诱导其他组织的胰岛素抵抗[2]。脂联素(adiponectin,Acrp30)是脂肪细胞特异性分泌的一种重要的脂肪细胞因子,在血中有较高的浓度(5~30g/ml),几乎占血浆总蛋白的0.01%[3,4]。近年来研究发现,脂联素的血浆水平在胰岛素抵抗和肥胖的情况下降低,在合并冠心病的患者中降低更加明显[5]。这一变化趋势与包括肿瘤坏死因子(TNF-),瘦素(leptin)和抵抗素(resistin)等在内的其他脂肪因子相反。脂联素作为一种多肽激素,具有改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化、降血糖、降血脂等作用,是一种潜在的治疗代谢疾病的新药靶。本研究旨在观察葡萄糖转运蛋白GLUT4和脂联素在3T3-L1脂肪细胞中的亚细胞分布,探讨其胞内运输调控机制。材料与方法1.材料:3T3-L1细胞株:购于北京协和细胞中心,由美国ATCC公司建系;细胞培养皿购自Corning公司;小牛血清(CS)和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;胰岛素(insulin)、地塞米松(dexamethasone)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)购自Sigma公司;山羊源adiponectin抗体购自R&D公司;鼠源GLUT4抗体购自Abcam公司;兔源PPAR抗体购自Thermo公司兔源-actin抗体购自康为世纪公司。2.方法:(1)3T3-L1细胞培养和分化:小鼠3T3-L1细胞以含有10%小牛血清的DMEM培养基传代培养。细胞汇合两天后,细胞培养液换为脂肪细胞分化诱导液(10%FBS,5g/ml胰岛素,1mol/L地塞米松,0.5mmol/LIBMX,DMEM)培养2天;换脂肪细胞分化培养液(10%FBS,5g/ml胰岛素,DMEM)培养2天,接着换10%胎牛血清的DMEM培养液维持培养,每2天换1次液。到第8天时细胞分化成熟,含脂滴的成熟的脂肪细胞数量增多,脂滴变大变圆。(2)蔗糖密度梯度离心:将分化的3T3-L1脂肪细胞(8天)用PBS清洗两遍,用刮刀将细胞收集于细胞裂解液(0.3mol/L蔗糖,5mmol/LEDTA,10mmol/LTris-HCl,pH7.4),用玻璃杵研磨裂解细胞。细胞裂解液经25G针头抽吸混匀20min。细胞裂解过程均在冰上操作。细胞裂解碎片和细胞核在4经500g离心15min去除。上清液继续在4经100000g离心1h(XL-90ultracentrifuge,Beck-man)。将富集于沉淀中的膜结构成分悬浮于细胞裂解液中,进行蔗糖密度梯度离心。蔗糖密度梯度管的制备包括从0.5mol/L到1.7mol/L,7个不同的浓度的蔗糖各1ml和管底铺2mol/L的蔗糖2ml。密度梯度离心管在4经200000g离心16h。离心后,收集不同密度区带中间相做Westernblot法检测。(3)Westernblot法检测:用细胞裂解液

参考文献

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