铁皮石斛种子共生萌发形态学观察

作者:张盈;李媛媛;陈晓梅;郭顺星; 刊名:首都师范大学学报(自然科学版) 上传者:王荣跃

【摘要】本研究以铁皮石斛种子-胶膜菌属菌根真菌共生体为实验材料,利用4种真菌特异性染剂,包括苯胺蓝(aniline blue)、氯唑黑E(chlorazol black E)、台盼蓝(trypan blue)和麦胚凝集素-异硫氰酸荧光素(wheat-germ agglutinin-fluorescein isothiocyante,WGA-FITC)染剂,整体透明试剂(Hoyer′s溶液)和多种显微观察仪器对共生萌发种子和原球茎进行形态学观察.研究结果显示4种真菌特异性染剂能有效检测菌根真菌在共生萌发种子和原球茎中的定殖,共生原球茎经过整体透明试剂处理后,最大程度展示了菌根真菌在皮层细胞内的结构和真实定殖情况.本研究为兰科植物种子共生萌发检测提供了多种简单有效的形态学方法.

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0 引 言 兰科植物是被子植物中最大、最进化的家族之一,许多种类具有较高的药用、观赏价值,如天麻(gastrodia elata)、铁皮石斛(dendrobium officinale)、福建金线莲(anoectochilus roxburghii)、蝴蝶兰(phalaenopsis aphrodite)等.兰科植物种子微小、没有胚乳,构造简单的种皮中包裹着一个未分化的胚[1],因此,兰科植物种子自身无法提供充足的营养以启动萌发.在自然条件下,种子必须与合适的菌根真菌建立共生关系才能够完成早期发育,这一特殊的萌发过程被称为共生萌发(symbiotic germination)[2].由于极低的自然繁殖率、独特的生存环境,以及人类对兰科植物生存环境的破坏和资源的过度利用,导致其处于濒危状态,野生自然资源几近枯竭.采用人工培养基进行种子非共生萌发是生产兰科植物种苗的主要来源[3].这种繁殖方式效率高,但获得的幼苗往往十分脆弱,移栽后生长缓慢、存活率低、易感染病害[4].随着兰科植物种子共生萌发研究的开展,科研工作者和业内人士开始认识到其优势.与非共生萌发相比,共生萌发得到幼苗的周期短,并且幼苗在萌发阶段就与菌根真菌建立共生关系,能够提高移栽成活率,有利于濒危植物回归自然生存环境[5].此外,菌根真菌还能保护种子免受其他微生物的侵害,提高抗逆性.这些特点吸引了越来越多的学者对兰科植物种子共生萌发进行深入研究. 兰科植物种子和共生萌发形成的原球茎体积很小,肉眼不易观察.虽然有关共生萌发的报道很多,但形态学方面的研究很有限.目前最常用的方法是在体视镜下观察共生萌发过程的各个阶段,进一步检测种子和原球茎是否被菌根真菌侵染,则采用石蜡切片、半薄切片和超薄切片方法进行观察[6-11].切片观察操作复杂,且周期较长.能否借鉴其他菌根共生形态学研究方法,找到一些操作简单,耗时短的观察方法应用于兰科植物种子共生萌发,检测菌根真菌在种子和原球茎中的定殖是值得研究的问题.铁皮石斛是我国传统的名贵中药,具有重要的药用价值和商业价值[12].本课题组经过多年研究,建立了铁皮石斛种子-胶膜菌属菌根真菌共生的稳定实验体系[13].因此,本研究以该共生体为实验材料,利用多种真菌特异性染剂结合显微观察仪器,以期为兰科植物种子共生萌发提供简单高效的检测方法,为兰科植物种子共生萌发机制进行更加深入的研究. 1 材料与方法 1.1 植物材料与供试菌株 铁皮石斛成熟蒴果于2018年12月采自云南西双版纳.促进铁皮石斛种子萌发的菌根真菌为胶膜菌属真菌(Tulasnella sp)S6(纯培养时具有念珠状细胞,在侵入种子的菌丝中不存在),分离自金钗石斛成年植株根部[13]. 1.2 试剂 磷酸盐吐温(PBST)缓冲液(0.01 mol/L,pH 7.4):1 000 mL磷酸盐(PBS)缓冲液(0.01 mol/L,pH 7.4)加入1 mL 吐温20. Hoyer′s 溶液:7.5 g 阿拉伯树胶、100 g 水合三氯乙醛、5 mL 甘油、60 mL 蒸馏水,在磁力搅拌器上混合均匀,直至溶液变透明. 苯胺蓝(aniline blue)、氯唑黑E(chlorazol black E)和台盼蓝(trypan blue,0.05% w/v):分别取3种染剂粉末100 mg添加到 100 mL 乳甘油(乳酸 ∶甘油 ∶水=1∶1∶1,v/v/v)溶液中. 麦胚凝集素-异硫氰酸荧光素(wheat-germ agglutinin-fluorescein isothiocyante,WGA-FITC)染剂(

参考文献

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